MICROSCOPIQUE

Par L.-F. HENNEGUY

Professeur remplaçant au Collège de France.

Nous ne nous occuperons ici que des méthodes générales de l'anatomie microscopique nécessaires pour l’étude des tissus, des organes ou des animaux de petite taille. Les méthodes spéciales destinées à immobiliser, à tuer, à disséquer les animaux et à examiner certains organes particuliers seront, en effet, indiquées pour chacune des espèces considérées dans cet ouvrage.

Ne pouvant, dans ce court résumé, donner même sommairement les formules et le mode de préparation des réactifs employés en anatomie microscopique, nous renverrons le lecteur aux ouvrages spéciaux, tels que le Traité technique d'histologie de Ranvier, le Traité des méthodes techniques de l'anatomie microscopique de Rolles Lee et Ilenneguy, où il trouvera, exposées avec détails, les méthodes que nous nous bornons à indiquer. Notre but, en résumant les méthodes générales de technique, est de donner aux débutants un guide qui leur

permette de faire un choix judicieux parmi les nombreux procédés actuellement en usage. Ce n’est qu’après s’être familiarisé avec ces méthodes, qui suffisent, en général, pour les études histologiques, que le zoologiste pourra aborder la technique nécessaire pour des recherches spéciales, telle que l’étude des centres nerveux ou des terminaisons nerveuses.

Lorsque le zoologiste veut faire une étude approfondie d’un animal quelconque, il doit, autant que possible, tâcher de se procurer plusieurs exemplaires de cet animal ; les uns seront consacrés à la préparation macroscopique des divers systèmes, soit par voie de dissection, soit par voie d’injection ; les autres seront réservés pour les recherches histologiques qui, pour donner de bons résultats, demandent une technique spéciale.

Les méthodes employées pour tuer les animaux très contractiles, en les asphyxiant, par exemple, dans l’eau privée d’air (Gastéropodes terrestres), ou en plaçant dans l’eau douce des animaux marins, permettent la dissection facile de ces animaux, mais altèrent considérablement leurs tissus. L’examen histologique des organes obtenus de cette manière donnerait une idée absolument fausse de la constitution de leurs éléments anatomiques. Il en est de même des animaux vivants, dont la dissection est faite dans l’eau, même additionnée de sel, comme cela se pratique habituellement.

Si l’espèce à étudier est rare et difficile à se procurer, et qu’on ne dispose, par exemple, que d’un seul exemplaire, on devra éviter de placer l’animal dans un liquide pouvant altérer les tissus.

Dans ce cas, on devra disséquer l’animal à sec ou mieux

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dans un liquide fixateur, tel que l’alcool à 90°, le liquide deKleinenberg, une solution d’acide chromique àl p. 300. La dissection pourra être ainsi poursuivie pendant un temps plus ou moins long, et les organes, convenablement fixés, pourront être examinés ultérieurement au point de vue histologique. S’il s'agit cfun animal de petites dimensions, on peut, avant de le disséquer, le fixer en entier, en le plongeant dans le liquide fixateur, après avoir pratiqué des incisions dans les téguments, ou après avoir injecté du liquide fixateur, à l’aide d’une seringue de Pravaz, dans la cavité générale du corps ; cette injection préalable donne de très bons résultats pour les Insectes, les Crustacés, et, en général, pour tous les animaux à téguments résistants.

Pour les animaux très contractiles, il est indispensable, avant de procéder à la fixation, de les anesthésier, afin d’empêcher la déformation des organes et le ratatinement des tissus. La chaleur, les fumigations de tabac et la nicotine, le chloroforme, l’éther, le chloral, la cocaïne sont les agents qu’on emploie le plus souvent pour immobiliser les animaux.

Préparations extemporanées. — Dans le cours d’une dissection, il est souvent utile de déterminer la structure d’un organe ou la constitution d’un tissu que l’on rencontre. Un examen rapide d’un fragment de cet organe ou de ce tissu permet, généralement, d’être fixé plus ou moins complètement à cet égard. Pour cela, on dissocie ce fragment, à l'aide d’aiguilles emmanchées, sur un porte-objet, soit à sec, soit dans une goutte d’eau salée à 0,06 p. 100, et l’on examine les produits de la dissociation

à l’état frais. Généralement ce premier examen est insuffisant pour se rendre compte de la nature des éléments auxquels on a affaire.

Il faut alors remplacer l’eau salée par un liquide fixateur, tel que le liquide de Ripart et Petit *, additionné d'une petite quantité de vert de méthyle. Sous l’influence de ce fixateur les éléments anatomiques perdant leur transparence et leur réfringence deviennent plus reconnaissables ; en même temps leurs noyaux, qui étaient à peu près invisibles à l’état frais, se montrent nettement colorés en vert bleuâtre. Si l’on désire conserver la préparation pendant un certain temps, il suffit de déposer sur le bord du couvre-objet une goutte de liquide de Brun-, qui, peu à peu, se mélange au liquide fixateur, éclaircit les éléments et conserve la coloration due au vert de méthyle. Le liquide de Ripart et Petit peut être remplace, dans beaucoup de cas, par une solution à 1 p. 100 d’acide osmique, qui convient très bien pour les éléments délicats, épithéliums, éléments nerveux, etc., et qui a l’avantage de noircir les globules graisseux, et, par conséquent, de déceler

1 Liquide de Ripart et Petit :

Eau camphrée .

Eau distillée .

Acide acétique cristallisable . . .

Acétate de cuivre .

Chlorure de cuivre .

2 Liquide de Brun :

Eau distillée .

Alcool camphré .

Glucose .

Glycérine .

Mêler ensemble l’eau, la glucose et la glycérine, ajouter l’alcool camphré et filtrer.

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leur présence dans les tissus. Après l'action de l'acide osmique, on peut colorer les noyaux à l’aide du carmin de Beale dilué, employé de la môme manière que le liquide de Brun ; la coloration est beaucoup plus lente qu’avec le vert de méthyle, et exige de vingt-quatre à quarante-huit heures.

Pour l’étude des membranes, on aura recours au procédé de demi-dessiccation de Ranvier, « qui consiste à étendre sur une lame de verre une membrane à l’aide des doigts appliqués sur ses bords. Tant que la membrane est humide, elle se rétracte, du moment qu’on l’abandonne à elle-même. Mais lorsqu’elle commence à sécher (et par suite de la chaleur des doigts qui la tendent, elle sèche plus vite sur les bords), ses bords restent adhérents au verre, et en l’attirant successivement sur ses différents cotés, on arrive à la tendre d’une façon complète ».

Macération et dissociation. — La dissociation des tissus à l’aide des aiguilles ne permet pas toujours d’isoler leurs éléments pour étudier leur forme, parce qu’ils sont réunis entre eux par des substances interstitielles dont la résistance s’oppose à leur séparation. On a recours, dans ce cas, à des agents macérateurs, qui ramollissent ou même détruisent ces substances unissantes ou certains éléments des tissus, tout en maintenant l’intégrité des formes de ceux qu’on désire isoler pour l’étude. On peut alors pratiquer facilement la dissociation, soit à l’aide des aiguilles, soit en agitant les tissus dans un liquide, soit en pratiquant une série de petits chocs répétés sur la lamelle recouvrant un fragment du tissu qui a macéré, placé sur un porte-objet dans une goutte de liquide.

Parmi les meilleurs agents macérateurs, nous signalerons le sérum iodé de Ranvier (liquide amniotique de Mammifères, saturé d’iode), Y alcool au tiers de Ranvier (1 partie d'alcool à 90° et 2 parties d’eau), le liquide de Hertioig (parties égales, acide acétique 0,2 p. 100 et d'acide osmique à 0,05 p. 100), un mélange en proportions variables suivant les tissus, d’une solution de sulfocyanure d’ammonium, de 10 à 1,25 p. 100 et de liquide de Ripart et Petit.

Le temps que les pièces doivent séjourner dans ces liquides varie suivant la nature des tissus et le résultat qu’on veut obtenir. Après dissociation, on peut colorer les éléments par le picro-carmin, l’hématoxyline, le vert de méthyle et faire des préparations permanentes à la glycérine ou au liquide de Brun.

Méthode des coupes. — La méthode des coupes, qui consiste à débiter en tranches minces et parallèles un objet quelconque, est la seule qui permette l'étude complète et approfondie d’un organe, d’un petit animal ou d’un embryon, dont les faibles dimensions rendent la dissection à peu près impossible ou dont l’opacité empêche l’examen par transparence. La méthode des coupes en séries, à laquelle on doit les rapides progrès de l’embryologie, est également applicable à la zootomie des petits organismes. Si l’on possède trois exemplaires d’une même espèce, on fera des coupes en séries de ces individus suivant trois directions perpendiculaires entre elles, les unes, par exemple, perpendiculaires au plan de symétrie de l’animal ; les autres, faites sur le second exemplaire, parallèlement à ce plan, et les dernières, faites sur le troi-

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sième individu, suivant une direction perpendiculaire aux deux premières; on aura de la sorte, pour ainsi dire, trois séries de projections dans trois plans différents, qui permettent de voir dans l’espace l’intérieur de l’animal avec tous ses organes et les rapports exacts de ces organes entre eux, de la même manière qu’on lit des épures de géométrie descriptive. Lorsqu’on ne possède qu’un seul exemplaire de l’espèce à étudier, on pourra, au moyen d’une seule série de coupes, reconstruire l’animal pour bien se rendre compte de sa configuration, de la forme de ses viscères, suivre le trajet d’un vaisseau ou d’un canal, etc., en ayant recours, soit au procédé très simple, mais un peu long, indiqué par Fol dans son Lelirbuch der Vergl. mikr. Anatomie , p. 35, ou aux autres méthodes exposées par Strasser dans Zeitsch. f. wiss. Mikr., 1886, p. 179.

Ces différentes méthodes sont applicables à la reconstruction d’un organe séparé comme à celle d’un animal ou d’un embryon entier.

Enfin, pour l’étude de la constitution histologique d’un organe, de simples coupes faites à main levée, à défaut de coupes en séries obtenues à l’aide d’instruments spéciaux, de microtomes, suffiront la plupart du temps.

Qu’un animal entier, ou un organe spécial de cet animal, soit destiné à donner des coupes isolées ou des coupes en séries, la suite des manipulations que doit subir cet animal ou cet organe est toujours la même ; elle comprend la fixation , le durcissement, la déshydratation, Y enrobement ou Yinclusion, la confection des coupes, leur coloration et leur montage dans un milieu conservateur.

La fixation doit être aussi rapide que possible, le durcissement, la déshydratation, l’inclusion et souvent la coloration doivent, au contraire, se faire en général lentement si l’on veut éviter les insuccès, c’est-à-dire si l’on veut obtenir des coupes dans lesquelles les éléments ne sont pas ratatinés, altérés et méconnaissables. Ce n’est qu’après une assez longue pratique, lorsqu’on possède certains tours de main que l’expérience seule peut apprendre, qu’on arrive à abréger beaucoup, dans certains cas, les différentes phases de la méthode des coupes.

I. Fixation. — Cette opération a pour but de tuer le plus rapidement possible les éléments anatomiques, tout en leur conservant la forme qu'ils possédaient pendant la vie.

Les agents fixateurs, de nature physique ou chimique, varient suivant les objets et le but qu’on se propose. Il n’en existe pas de parfaits, d’un usage général. Nous nous bornerons à indiquer les avantages et les inconvénients des principaux agents fixateurs afin que, dans chaque cas particulier, on puisse choisir celui qui donnera le meilleur résultat.

1. Chaleur. — La fixation par la chaleur est applicable aux animaux ou aux tissus entourés d’enveloppes imperméables aux liquides, tels que les petits Insectes, beaucoup d'Arachnides, quelques Vers, certains œufs, etc. On place les objets à fixer dans une petite quantité d’eau qu’on porte rapidement à 70° ou 80° C., .ou bien on jette les objets dans de l’eau préalablement portée à la température voulue et on les y laisse séjourner quelques secondes ou quelques minutes, suivant leurs dimensions. Au sortir de l’eau chaude, les objets sont mis dans l’alcool ou dans un autre liquide durcissant pour leur donner une

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consistance suffisante permettant de faire des coupes.

La méthode de fixation par la chaleur a l’avantage de n’introduire dans les objets aucune substance pouvant modifier leur constitution chimique ; aussi doit-elle être employée lorsqu’on se propose de faire sur les coupes des recherches microchimiques. Elle a l’inconvénient de modifier souvent la structure des éléments anatomiques qui renferment de la graisse; celle-ci est, en général, expulsée des cellules dont les parois sont déchirées et renferment alors des vacuoles vides. Souvent aussi, après simple fixation par la chaleur, la coloration des coupes est diffuse et manque d’élection.

On peut, dans beaucoup de cas, lorsqu’il s’agit d’objets difficiles à fixer, associer l’action de la chaleur à celle d’un agent chimique dont la pénétration est alors facilitée. Il suffit généralement, dans ce cas, de porter l’agent fixateur à une température de 35° à 50° C.

2. Alcool. — L’alcool fort à 93° ou absolu présente les mêmes avantages que la chaleur ; il a un pouvoir de pénétration bien supérieur à celui des liquides aqueux et n’altère pas en général la constitution chimique des éléments ; mais il ratatine le plus souvent les tissus. L’alcool à 90° ou 80° produit moins de ratatinements et devra être préféré à l’alcool absolu quand on aura affaire à des tissus facilement perméables. Si cet agent employé comme fixateur donne, la plupart du temps, des résultats inférieurs à ceux des fixateurs en solutions aqueuses, la facilité qu’on a de se le procurer à peu près partout le rend très utile en voyage, quand on veut rapporter des pièces dont on se propose de faire l’examen histologique.

Il faut seulement avoir soin de changer souvent l’alcool pour empêcher les tissus de macérer et de conserver ensuite la pièce dans de l’alcool à 70° ou 75° jusqu’au moment où l’on fera les coupes.

3. Acide osmique. — En solution dans l’eau distillée à 1 ou 2 p. 100, l’acide osmique est un excellent fixateur pour les très petits objets, Infusoires, larves d’Échinodermes, de Vers, et les membranes. On peut employer aussi les vapeurs qui se dégagent d'un flacon renfermant une solution d’acide osmique pour fixer de petits organismes ou des éléments dissociés en suspension dans une goutte de liquide placée sur un porte-objet qu’on renverse au-dessus du goulot du flacon contenant la solution. S'il tue rapidement les organismes et les éléments anatomiques en conservant bien leur forme, l’acide osmique présente plusieurs graves inconvénients ; il est très peu pénétrant, colore fortement en noir, surtout les tissus renfermant des substances graisseuses ; il a une tendance à diminuer le volume des éléments cellulaires, et gêne beaucoup les colorations ultérieures.

Pour obvier à ces divers inconvénients, il faut laver, pendant longtemps et avec soin, à l’eau, les pièces fixées, et les mettre ensuite, pendant vingt-quatre heures, dans le liquide de Muller. On peut aussi faire disparaître la coloration noire en traitant les objets par une solution diluée d’eau oxygénée.

4. Acide chromique. — Employé en solution dans l'eau de 1 p. 1000 à 1 p. 100, l’acide chromique doit être considéré comme l’un des meilleurs agents fixateurs, surtout lorsqu’il est associé à l’acide osmique et à l’acide acétique,

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comme dans le liquide de Flemming. Malheureusement, il agit lentement et son action n’est pas égale ; suivant le degré de concentration de la solution, l’acide cliromique fixe trop énergiquement les parties périphériques ou pas assez les parties centrales ; aussi ne peut-on l’employer pour des pièces un peu volumineuses, ayant plus d’un demi-centimètre d’épaisseur. La concentration de la solution doit être en rapport avec la délicatesse des tissus à fixer ; plus ceux-ci sont délicats, plus la solution sera faible.

La fixation par l’acide cliromique exige une immersion dans une assez grande quantité de liquide pendant plusieurs heures. On peut laisser séjourner longtemps les objets dans les solutions à 0,5 p. 100, l’acide cliromique étant un agent durcissant en même temps que fixateur. Mais il faut avoir soin, après la fixation, de laver longtemps les pièces à l’eau, jusqu’à ce que celle-ci reste incolore, de manière à enlever l’acide cliromique qui ne s’est pas combiné avec les éléments des tissus, sans quoi la coloration des coupes devient très difficile.

5. Acide picrique. — Cet acide s’emploie en solution aqueuse saturée à froid. C'est un fixateur très pénétrant, mais peu énergique , coagulant faiblement et d’une manière passagère les substances albuminoïdes. Les objets un péu volumineux peuvent y séjourner pendant plusieurs jours ou même davantage sans inconvénient. Après la fixation on doit enlever tout l’acide picrique par des lavages à l’alcool à 70°. Ce lavage exigeant une grande quantité d'alcool et un temps très long, qu’on peut, il est vrai, abréger en employant de l’alcool porté à une

température de 40°, C., rend peu commode l’emploi de l’acide picrique. On lui préfère généralement le liquide de Kleinenberg, avec lequel la technique de la tixation est la même, mais qui a l’avantage d’être un fixateur plus énergique et de se laisser enlever plus facilement au lavage. Ce liquide donne de très bons résultats avec les Invertébrés marins ; il a seulement le défaut de gonfler le tissu conjonctif et de donner des précipités de sulfate de chaux dans les objets qui renferment des éléments calcaires.

6. Acide nitrique. — En solution aqueuse à 3 p. 100, d’une densité de 1,02 environ, l’acide nitrique fixe à peu près comme le liquide de Kleinenberg ; il est cependant moins pénétrant; il présente l’avantage d’exiger un lavage à l’alcool moins long. Il est surtout employé pour les jeunes embryons.

7. Sublimé corrosif. — Le bichlorure de mercure est l’agent fixateur dont l’action est la plus rapide et la plus énergique. Il s’emploie en général en solutions aqueuses concentrées, saturées à froid, soit dans l’eau pure, soit dans l’eau salée à 0,6 p. 100, qui en dissout une plus forte proportion. Pour les Arthropodes on peut se servir d'une solution alcoolique qui pénètre mieux à travers la chitine ; pour les animaux très contractiles (Turbellariés, Némertiens, etc.), on a recours à des solutions chaudes ou même bouillantes.

Les pièces doivent séjourner dans les solutions le moins de temps possible, sans quoi elles deviennent cassantes. Le sublimé doit être extrait par un lavage soigneux à l'eau ou mieux à l'alcool, en se servant d’alcool d'abord à 50°, puisa 70°, 80° et 90°. Malgré un lavage prolongé, il reste

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presque toujours dans les tissus des grains noirs microscopiques, dus à une réduction du sublimé et qu’on ne peut enlever que par l’iode. Aussi est-il nécessaire d'ajouter de la teinture d’iode à l’alcool de lavage ; l’alcool jauni par l’iode se décolore tant qu’il reste du sublimé dans la pièce. On ajoute de l’iode jusqu’à ce que l’alcool ne se décolore plus.

Le sublimé entre dans la composition de plusieurs liquides fixateurs, tels que ceux de Lang, de Gilson, de Zenker, etc., qui peuvent souvent remplacer avantageusement la solution aqueuse.

Liquides fixateurs composés. — Nous donnons ici la composition des meilleurs liquides employés soit en histologie, soit en embryologie ou en cytologie, et qui, constitués par un mélange de plusieurs agents fixateurs, tels que ceux que nous avons cités plus haut joints à d’autres moins importants, jouissent à la fois des divers avantages de leurs composants.

Liquide de Flemming :

Acide chromique à 1 p. 100 . 15 parties

— osmique à 2 — . 4 —

— acétique cristallisable . 1 —

Même usage que la solution d’acide chromique, même mode d’emploi. Le meilleur des agents fixateurs; présente à la fois les avantages de l’acide osmique et de l’acide chromique, sans en avoir les inconvénients; noircit à peine les tissus, qui peuvent y séjourner très longtemps où ils durcissent après avoir été fixés.

Liquide de Hermann :

Chlorure de platine à 1 p. 100 . 15 parties

Acide osmique à 2 — . 4 —

— acétique cristallisable . 1 —

S’emploie comme le liquide de Flemming.

Liquide de Lindsay Johnson :

Bichromate de potasse à 2,5 p. 100. . . 70 parties

Acide osmique à 2 — ... 10 —

Chlorure de platine à 1 — ... 15 —

Acide acétique cristallisable . 5 —

S’emploie comme le liquide de Flemming.

Liquide de Iileinenberg :

Eau distillée . 100 volumes

Acide sulfurique concentré . 2 —

Ajouter de l’acide pricrique autant qu’il s’en dissoudra. Filtrer et ajouter 3 volumes d’eau (excepté pour la fixation des Arthropodes).

Laisser les pièces de trois à vingt-quatre heures, puis laver à l’alcool à 70° jusqu’à décoloration.

Liquide de Zenker :

Eau . 100 parties

Bichromate de potasse . 2,5 —

Sulfate de soude . 1 —

Sublimé corrosif . 5 —

Acide acétique cristallisable . 5 —

Fixer les pièces pendant quelques heures, laver longtemps à l’eau, puis à l’alcool à 50°, à 70° iodé, et à 90°.

Liquide de Lan y :

Eau distillée. . . .

Chlorure de sodium Acide acétique. . .

Sublimé corrosif. .

Alun .

100 parties 6 à 10

Employé surtout pour les animaux marins, mous et très contractiles.

Liquide de Gilson :

Eau distillée . 4 400 grammes

Alcool à G0° . 500 c. c.

Sublimé . 95 à 100 grammes

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Acide nitrique à 46° Baumé . .

Acide acétique cristallisabie . .

Pour les animaux marins, ajouter au fond du flacon quelques cristaux d’iode.

II. Durcissement. — Celte opération a pour but de donner aux tissus une consistance suffisante pour pouvoir être coupés. La plupart des agents fixateurs que nous avons indiqués, en même temps qu’ils tuent et conservent la forme des éléments des tissus, leur donnent une consistance supérieure à celle qu’ils possèdent normalement, et se comportent par conséquent comme des agents durcissants. En général, il est donc inutile de recourir à des réactifs spéciaux pour durcir les pièces fixées par les liquides les plus habituellement employés ; le durcissement se continue pendant les traitements successifs par des alcools de plus en plus forts qui produisent en même temps la déshydratation.

Cependant, après la fixation par la chaleur, on pourra avec avantage durcir les pièces en les laissant pendant quelques jours dans une solution d’acide chromique à 0,5

III. Déshydratation. — Les pièces fixées et durcies qui ne sont pas destinées à être débitées immédiatement en coupes seront conservées de préférence dans de l’alcool faible à 70° ou 75°, ou encore dans un mélange environ à parties égales d’alcool, d’eau et de glycérine.

Si l’on veut, ce qui est le cas le plus habituel, inclure les pièces destinées à être coupées dans la paraffine ou dans le collodion, il est indispensable de les déshydrater préalablement en les faisant passer dans des alcools de

plus eh plus forts, à 70°, 75°, 80°, 90°, 95° et l’alcool absolu. Après fixation par les liquides renfermant de l’acide picrique ou du sublimé, la déshydratation doit se faire lentement et graduellement en laissant les pièces environ douze heures dans chaque alcool ; il vaut mieux ne pas mettre les pièces dans l’alcool absolu et s’arrêter à l’alcool à 95°. Après fixation par les liquides chromiques, on peut commencer sans inconvénient la déshydratation par l’alcool à 80°.

IV. Enrobement et inclusion. — L’enrobement consiste à englober les pièces dans des substances plastiques qui les soutiennent de tous côtés de manière à permettre de les couper en tranches minces sans les comprimer et sans déranger les rapports de leurs parties. Cette méthode, plus rapide et plus facile à employer que celle de l’inclusion, ne peut s’appliquer qu’aux pièces ayant une certaine consistance, compactes et homogènes. Elle permet de faire des coupes à main levée, sans l’emploi d’instruments spéciaux, de microtomes, mais, à moins d'une grande habileté, elle ne donne que des coupes relativement épaisses ne permettant pas un examen à l’aide de forts objectifs.

L’enrobement le plus simple consiste à caler la pièce à couper avec des morceaux de moelle de sureau dans la cavité d’un microtome Ranvier, puis à couler dans cette cavité un mélange à parties égales de cire et d'huile fondu ou de paraffine également fondue. La pièce, avant d’être introduite dans le microtome, sera rapidement promenée sur une feuille de papier à filtrer afin de la débarrasser autant que possible du liquide qui l'impré-