TECHNIQUE M I C H 0 S C 0 P I Q U E

Les objets préalablement déshydratés par l’alcool absolu sont placés pendant quelques heures dans un mélange d’éther et d’alcool absolu, puis portés dans une solution de 10 parties de celloïdine pour 105 parties de mélange d’éther et d'alcool, où ils séjournent pendant quelques jours ou plusieurs semaines, selon leurs dimensions i. Lorsqu’ils sont bien pénétrés, on les met dans une solutiou plus forte (10 parties de celloïdine pour 80 parties du mélange), où on les y laisse encore quelque temps, puis on les dispose dans une petite boîte en papier avec une certaine quantité de la solution pour les inclure. Au bout de quelque temps, quand, par suite de l’évaporation de l’alcool et de l’éther, il s'est formé une pellicule à la surface de la masse à inclusion, on place la boîte en papier dans le chloroforme pur, où la masse prend une consistance suffisante pour être coupée.

Les coupes se font avec le rasoir tenu obliquement et mouillé avec de l’essence de térébenthine ou de l’essence de cèdre. Elles sont ensuite collées sur le porte-objet à l’aide de la solution de Schællibaum (une partie de collodion pour 3 ou 4 parties d’essence de girofle).

Inclusions au savon et à la gélatine. — Pour certains organismes très délicats et très riches en eau, tels que les Cœlentérés, la déshydratation par l’alcool fort amène un ratatinement considérable des tissus et empêche l’inclusion dans la paraffine ou le collodion. On emploie dans ce cas comme masse à inclusion soit une solution de 25 grammes de savon blanc dans 100 centimètres cubes d'alcool à 96°, à laquelle on ajoute

1 On peut accélérer la pénétration des objets par la solution faible de celloïdine, en faisant bouillir celle-ci à une basse température, celle de la paraffine fondue ; la solution s’épaissit et on peut y inclure directement les objets.

ensuite 5 à 10 grammes d’eau, soit une solution de gélatine (20 grammes de gélatine pour 200 grammes d’eau, et 2 grammes de sublimé dans 30 centimètres cubes d’acide acétique cristallisable) qu’on durcit ensuite par l’alcool à 90°.

V. Colorations. — La coloration des pièces histologiques a pour but de rendre plus visibles leurs éléments constituants et surtout de les différencier autant que possible, en leur donnant des teintes diverses.

Elle peut se faire à deux moments différents des manipulations qu’on fait subir aux objets destinés à être coupés : 1° après la fixation et le durcissement, c’est la coloration en bloc ou in loto ; 2° après la confection des coupes. Le premier procédé ne donne de bons résultats qu’avec les petits objets, se laissant facilement pénétrer par les liquides, et n’est applicable qu’avec l’emploi d’un très petit nombre de teintures ; le second, généralement préférable, peut s’employer avec n’importe quelle teinture et permet d’obtenir des colorations beaucoup plus précises et plus différenciées.

Quel que soit de ces deux procédés celui qu’on adopte, la coloration peut se faire d’une manière progressive ou d’une manière régressive. Dans le premier cas, l’objet et les coupes à colorer sont mis dans une solution renfermant une petite quantité de substance colorante, et on les y laisse jusqu’à ce que les éléments aient acquis le degré de coloration voulu. Dans le second cas, on surcolore les objets ou les coupes dans une solution riche en matière colorante, puis on les décolore en arrêtant l’opération au moment où l’on juge la coloration convenable.

Le nombre des substances colorantes employées par les histologistes étant actuellement considérable, et le mode

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d’emploi de ces diverses substances étant très varié, nous ne pouvons ici que signaler celles dont l’usage est le plus fréquent et l’application la plus générale.

Les substances colorantes histologiques se divisent en déux groupes : les couleurs basiques ou colorants nucléaires , ayant de l’affinité pour les matières albuminoïdes riches en phosphore, les nucléines, et les couleurs acides ou colorants plasmatiques, ayant de l’affinité pour les matières pauvres en phosphore et n’en contenant pas.

Les colorants nucléaires s’emploient généralement seuls ; en se fixant sur les noyaux des éléments, ils mettent ceux-ci en évidence et permettent d’en déterminer la place et partant celle des éléments qui les renferment.

Les colorants plasmatiques, ne donnant qu’une teinte générale diffuse, s’emploient associés aux colorants nucléaires. On obtient ainsi une double coloration : une coloration des noyaux et une coloration du protoplasma d’une nuance différente, ou coloration de fond, qui permet de mieux délimiter les éléments cellulaires.

Certaines substances colorantes, telles que \epicro-carmin et Yhématoxyline , donnent à la fois une coloration nucléaire et plasmatique et sont recommandables pour la plupart des études histologiques.

Picro-carmin de Ranvier. — S’emploie par la méthode progressive, dilué dans l’eau ; colore les noyaux en rouge, le protoplasme en orange, la substance interstitielle du tissu conjonctif en jaune; colore rapidement après fixation par l’alcool, l’acide picrique ou le sublimé, difficilement après l’action des sels de chrome.

Les coupes colorées à point sont montées dans la glycérine

acidifiée par l’acide acétique ou l’acide formique et contenant un peu de picro-carmin, ou dans le baume d’après le procédé que nous indiquerons plus loin.

Hématoxyline de Delafield. — S’emploie, comme le picro-carmin, par la méthode progressive, très diluée dans l’eau distillée; colore après fixation par les liquides chromiques et osmiques aussi bien qu’après le sublimé ; les noyaux sont colorés en bleu violacé foncé, le protoplasma en bleu clair, si le séjour des coupes dans la solution est suffisante. Après coloration, laver les coupes dans l’eau ordinaire, et monter dans la glycérine neutre, ou dans le baume.

Coloration en niasse. — Les seuls colorants pratiques pour colorer de petits objets entiers avant l’inclusion sont le carmin au borax alcoolique de Grenadier et le carmin aluné acide , après fixation par l’alcool, le sublimé et l’acide picrique, et Yhémalun de Mayer , après n’importe quelle fixation.

Les objets doivent séjourner au moins vingt-quatre heures dans ces colorants non dilués. Après le carmin de Grenadier, on les met dans l’alcool à 70° acidulé de quatre à six gouttes d’acide chlorhydrique pour 100 centimètres cubes, pendant au moins vingt-quatre heures, puis dans l’alcool pur. Après le carmin aluné acétique, on lave pendant une heure ou deux dans l’eau distillée, et après l’hémalun pendant vingt-quatre heures dans l’eau distillée ou dans une solution d’alun au centième. Ces trois colorants donnent une coloration nucléaire très précise.

Couleurs d'aniline. — Ces couleurs dont l’emploi tend de plus en plus à se généraliser, parce qu’elles permettent d’opérer rapidement et d’obtenir, au moyen de colorations combinées, une différenciation élective des divers éléments

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constitutifs des tissus, ne donnent de bons résultats que lorsqu’on s'en sert pour colorer, par la méthode régressive, les coupes fixées sur le porte-objet, et principalement les coupes provenant d’objets fixés par les liquides chromiques : celles-ci doivent être montées au baume de Canada.

Parmi les colorants nucléaires, la safranine, le violet de gentiane, la thionine, le bleu de méthylène, sont les plus importants et les plus faciles à employer ; parmi les colorants plasmatiques, la fuchsine acide, le Lichtgrün F. S., l’éosine, l’orange G.

Les colorants nucléaires s’emploient par la méthode régressive. Les coupes doivent séjourner dans les solutions colorantes un temps suffisant pour y prendre une teinte foncée uniforme ; on les décolore ensuite en partie par l’alcool absolu, auquel on substitue de l’essence de girofle qui achève d’enlever l’excès de matière colorante. Il est utile de surveiller la décoloration, en examinant la préparation à un faible grossissement ; dès qu’on voit les noyaux seuls colorés, on enlève l’essence qu'on remplace par du baume de Canada. Si la décoloration se fait rapidement, on l’arrête brusquement au point voulu, en substituant à l’essence du xylol, dans lequel la plupart des couleurs d’aniline ne sont pas solubles, puis on remplace le xylol par le baume.

Les colorants plasmatiques s'emploient généralement par la méthode progressive.

On obtiendra une bonne coloration à la fois nucléaire et plasmatique en procédant de la manière suivante : les coupes collées sur le porte-objet et débarrassées de la paraffine sont recouvertes d’une solution de safranine (mélange à parties égales d’une

solution alcoolique concentrée de safranine et d’eau anilinée1) et placées dans une chambre humide, où elles séjournent environ vingt-quatre heures. On fait écouler la solution qui peut servir pendant longtemps , et on lave rapidement à l’alcool absolu. Une partie de la safranine est enlevée, mais les coupes sont encore uniformément colorées en rouge. Puis on verse sur le porte-objet une solution de 5 grammes de Lichtgriin dans 200 centimètres cubes d’alcool, et au bout d’une demi-minute on lave rapidement à l’alcool absolu, puis on éclaircit par l-’essence de girofle, et on examine la préparation à un faible grossissement pour surveiller la décoloration. Dès que les noyaux se montrent seuls colorés en rouge et le reste des coupes en vert, on substitue du xylol à l’essence de girofle et on monte la préparation au baume de Canada.

Si l’on se contente d’une coloration nucléaire, on peut raccourcir beaucoup le temps nécessaire pour colorer les coupes en traitant d’abord celle-ci par un mordant, tel que la teinture d’iode ou le permanganate de potasse. Il suffit alors d’un séjour de quelques minutes dans la solution de safranine, pour avoir les noyaux d’une belle teinte rouge.

Les autres colorations combinées qu’on peut recommander sont : safranine et Kernschwarz, safranine, violet de gentiane et orange G (méthode de Reinke), violet de gentiane ou thionine et éosine, bleu de méthylène et fuchsine acide. On doit laisser agir plus longtemps les colorants nucléaires que les colorants plasmatiques, employer des solutions plus concentrées des premiers que des seconds et les colorants plasmatiques après les colorants nucléaires2.

Montage des coupes. — Les milieux conservateurs

4 L’eau anilinée se fait en agitant un peu d’huile d’aniline avec de 1 eau qu’on filtre ensuite.

- Pour la coloration par le bleu de méthylène et la fuchsine acide, il faut au contraire laisser les coupes pendant plusieurs heures dans une solution aqueuse faible de fuchsine acide, puis quelques minutes seulement dans une solution aqueuse assez forte de bleu de méthylène, laver ensuite à l’alcool absolu, surveiller la décoloration par l’essence de girolle et monter au baume.

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habituels sont : la glycérine, le liquide de Brun, le baume du Canada ou la résine dammar, dissous dans le chloroforme ou le xylol.

La glycérine ne convient que pour les coupes ou les petits animaux colorés par les carmins et les hématoxylines. Si les coupes n'ont pas été fixées sur le porte-objet, il faut les placer sous une lamelle avec de l’eau, et mettre sur le bord de la lamelle une goutte de glycérine. Celle-ci se mêle lentement à l’eau, qui finit par s’évaporer : on empêche ainsi le ratatinement des coupes. La glycérine, moins réfringente que le baume, permet mieux de voir les éléments délicats, lorsqu’ils n’ont pas été colorés.

Le liquide de Brun peut servir pour conserver des coupes colorées par les couleurs d’aniline, entre autres par le vert de méthyle employé par la méthode progressive.

Les préparations montées à la glycérine sont fermées par une bordure à la paraffine, appliquée tout autour de la lamelle à l’aide d’une aiguille courbe chauffée, ou par une bordure d’un vernis à la gomme laque, faite avec un pinceau.

Le liquide de Brun prend, en séchant, une consistance suffisante pour ne pas nécessiter la bordure des préparations.

'‘Le baume de Canada et la résine dammar constituent un milieu très réfringent qui éclaircit beaucoup les préparations fortement colorées et qui est indispensable après les colorations par les couleurs d’aniline. Nous avons indiqué plus haut la manière de monter au baume après coloration régressive. Pour les coupes colorées par les carmins ou les hématoxylines, il faut d’abord les déshy-

drater par l'alcool absolu, puis les éclaircir par l’essence de girolle ou par le xylol, et c’est alors seulement qu’on les met dans le baume. Le meilleur procédé pour monter des coupes au baume consiste à déposer une goutte de celui-ci sur une lamelle qu’on retourne et qu’on dépose sur les coupes placées sur le porte-objet ; en appuyant légèrement sur la lamelle, on force la goutte de baume à s’étendre, ou bien on chauffe un peu le porte-objet, et le poids seul de la lamelle suffît à faire étendre le baume rendu plus fluide par la chaleur. Les préparations sont mises ensuite à sécher pendant quelques jours dans une étuve entre 40° et 50°, et il est inutile de luter les lamelles.

Imprégnations. — Les imprégnations au moyen de sels métalliques, d’argent ou d’or, ont pour but de déterminer dans certains éléments la formation d'un dépôt de métal à l’état de très fine division, dépôt formé par les énergies chimiques des tissus aidées par l’action d’agents réducteurs, et qui met nettement en évidence ces éléments. Les imprégnations à l’argent servent surtout pour l’étude des épithéliums et endothéliums, celles à l’or pour les recherches des terminaisons nerveuses. Elles ne peuvent se faire que sur des tissus frais n’ayant été traités par aucun réactif.

Imprégnations a l’argent. — Elles peuvent, suivant le mode d’emploi du sel d’argent, donner des imprégnations négatives dans lesquelles les substances intercellulaires sont seules colorées en noir ou en brun, ou des imprégnations positives , dans lesquelles ces espaces intercellulaires restent incolores, tandis que les cellules sont

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colorées. Les premières sont primaires et se produisent par réduction immédiate de l’argent dans les espaces intercellulaires ; les imprégnations positives sont secondaires : elles ont lieu lorsque la réduction du métal n’est pas assez énergique lors de l’imprégnation primaire. On cherche généralement à obtenir des imprégnations négatives qui servent à bien déterminer les limites et les contours des cellules épithéliales.

On se sert de solutions de nitrate d’argent dans l’eau distillée de 1 p. 300 à 1 p. 500. La membrane ou les tissus imprégnés, préalablement bien étendus, sont lavés rapidement à l’eau distillée et on verse dessus la solution d’argent1. L’opération doit se faire au soleil ou à une vive lumière. Quand le tissu blanchit, ou commence à prendre une teinte grisâtre, on lave à l’eau distillée et on examine la préparation ou on la monte dans la glycérine.

Pour étudier l’endothélium des vaisseaux ou de cavités cœlomiques, on injecte la solution au moyen d’une petite seringue.

Les animaux marins, renfermant dans leurs tissus une assez grande quantité de chlorure de sodium, ne peuvent être traités directement par le nitrate d’argent. 11 faut les placer d’abord à l’état vivant dans une solution à 5 p. 100 de nitrate de potasse dans l’eau distillée, où ils se débarrassent en grande partie de leur sel marin, et, après leur mort, on peut procéder à l’imprégnation (méthode de Harmer).

Imprégnations a l’or. — Elles se font avec des solutions de chlorure d'or et servent à la recherche des terminai-

1 On peut aussi immerger les objets dans la solution en ayant soin de les agiter constamment.

sons nerveuses qui se colorent en violet foncé1. Le meilleur procédé est celui au jus de citron de Ranvier.

« Les fragments de tissu sont placés pendant cinq à dix minutes dans le jus de citron fraîchement exprimé et filtré suide la flanelle. Ils y deviennent transparents. On les lave rapidement à l’eau distillée, puis on les porte dans une solution de chlorure d’or à 1 p. 100, où on les laisse séjourner dix minutes à une heure (suivant les tissus); après quoi on les lave de nouveau à l’eau distillée et on les place dans un flacon contenant 50 grammes d’eau distillée et 2 gouttes d’acide acétique. Au bout de vingt-quatre à quarante-huit heures et sous l’influence de la lumière la réduction de l’or est produite. On fixe les tissus par l’alcool et on fait des préparations suivant les procédés ordinaires. »

Etude des objets durs. — Nous n’avons considéré jusqu'ici que des méthodes applicables à l’étude d’objets de consistance plus ou moins molle, qui doivent être durcis et inclus pour pouvoir être, coupés. Lorsqu’on a affaire à des organes ou des tissus très résistants, tels que pièces de squelette osseux ou chitineux, coquilles, polypiers, etc., il faut avoir recours à des procédés spéciaux. On peut, ou bien ramollir ces objets durs et pratiquer ensuite les coupes par les méthodes ordinaires, ou bien couper, à l’aide d’une petite scie, dans ces objets des lamelles, qu’on rend ensuite aussi minces que possible en les usant sur une meule, puis entre deux pierres ponces, et enfin sur une pierre fine à aiguiser.

1 On remplace généralement aujourd’hui les imprégnations au chlorure d’or pour l’étude des terminaisons nerveuses par la coloration à l’aide du bleu de méthylène sur le vivant ou sur les tissus frais. Voir à ce sujet le Traité de Boites Lee et Ilenneguy , 2° édition, p. 144 et suiv.

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Décalcification. — Quand il s'agit d'objets incrustés de sels calcaires, on les traite par des réactifs dissolvants de ces sels. Si les objets ne renferment que peu de sels de chaux, un séjour prolongé dans une solution d’acide chromique ou d'acide picrique suffit à les en débarrasser en même temps qu’elle fixe la trame organique. Si l’objet contient à la fois des parties molles et des parties dures (un os entouré de muscles, par exemple), on le fixe d’abord par un des réactifs que nous avons indiqué à propos de la fixation, puis on procède à la décalcification en le laissant séjourner dans une solution d’acide nitrique ou d’acide chlorhydrique à 1 p. 10.

Procédé de E. Rousseau h — Ce procédé permet d’obtenir en même temps de bonnes coupes de parties molles et de parties squelettiques in situ.

Fixer par les méthodes ordinaires et inclure dans la celloïdine. Après durcissement du bloc de celloïdine, mettre celui-ci pendant douze heures à trois jours (suivant la richesse des tissus en calcaire) dans un mélange de 10 à 50 parties d’acide nitrique pour 100 parties d’alcool à 90°. Puis laver les pièces pendant quelques jours dans de l’alcool à 90°, souvent renouvelé et contenant un peu de carbonate de soude. On peut alors couper et colorer les coupes.

Ramollissement de la chitine. — Faire macérer les organes chitineux pendant vingt-quatre heures au plus, suivant leur grosseur, dans de l’eau de Javel étendue de quatre à six fois son volume d’eau.

Injections microscopiques. — Lorsqu’on veut étu-

1 E. Rousseau. Une nouvelle méthode de décalcification. Bull, de la Soc. belge de microsc ., XXIII, 1898.

dier le trajet et la distribution de vaisseaux ou de canalicules très fins, qui sont invisibles même au microscope, parce que leurs parois sont trop minces et trop transparentes, et parce qu’ils renferment un liquide incolore, on les met en évidence en injectant dans leur intérieur une substance colorée.

Si l’on veut se contenter des préparations extemporanées, destinées à être examinées à un faible grossissement pour voir seulement les vaisseaux et en prendre un dessin, un procédé rapide consiste à injecter un précipité de cliromate de plomb, obtenu en mélangeant une solution de 60 parties cfacétate de plomb dans 100 centimètres cubes d’eau avec une solution de 25 parties de bichromate de potasse dans la même quantité d’eau. Ce procédé très simple peut rendre de grands services pour la dissection fine des vaisseaux et des canaux excréteurs ou glandulaires.

Mais si l’on désire avoir des préparations permanentes, et des coupes minces dans lesquelles les vaisseaux ou les canalicules seront nettement visibles, parce qu’ils resteront remplis d’une substance colorée, il faut avoir recours à une masse d’injection transparente. On emploiera les masses à la gélatine de Ramier colorées au carmin ou au bleu de Prusse, dont la préparation est assez délicate, mais qui donnent de très bons résultats.

La technique des injections fines demandant à être exposée avec détail, nous ne pouvons, étant donné le cadre de ce chapitre, que renvoyer le lecteur au chapitre ix du livre I du Traité de Ranvier, où il trouvera décrits le mode de préparation des masses à injection, la description des appareils spéciaux pour les injecter, et la manière d’opérer.