PROCÉDÉ DE CONSERVATION DES COUPES MACROSCOPIQUES PRATIQUÉES

sur des cerveaux durcis dans les bichromates. — Les coupes microscopiques sériées, pratiquées au microtome de Gudden, sont colorées et

montées par les procédés ordinaires. De même, lorsqu'un hémisphère a été débité au microtome de Gudden, en coupes macroscopiques sériées d'un millimètre d'épaisseur, il est avantageux de pouvoir conserver ces coupes.

Nous employons dans ce but un procédé de conservation par la gélatine stérilisée. On prépare la solution suivante :

Gélatine 250 grammes.

Eau 2000 —

Solution de sublimé à 1/10. ... 2j cent, cubes.

On chauffe ce mélange jusqu'à dissolution complète de la gélatine, on l'éclaircit à l'aide d'un blanc d'oeuf, on le filtre puis on le verse dans une cuve en porcelaine et on laisse refroidir jusqu'à 40° ou 35°.

On prend ensuite les coupes les unes après les autres et on les traite de la manière suivante : chaque coupe, reposant sur une feuille de papier à filtre numérotée, est appliquée sur une lame de verre (de vitrier), on retire la feuille de papier et on sèche la coupe à l'aide de feuilles de papier buvard, jusqu'à ce qu'elle ait acquis un degré de dessiccation suffisant pour adhérer au verre; — on plonge ensuite la coupe et la lame dans la gélatine liquide, on recouvre d'une autre lame de verre, de dimension inférieure à la précédente, on place un poids de 500 grammes environ sur la lame supérieure et on attend la solidification de la gélatine. Puis on sort la préparation en exerçant quelques mouvements de latéralité, on la nettoie sur ses deux faces et on la borde avec de la paraffine, de la cire à cacheter dissoute dans l'alcool, ou du baume de Canada sec dissous à l'aide de la chaleur. On obtient ainsi des préparations persistantes. Cette méthode rend des services non seulement au point de vue de renseignement de l'anatomie topographique — coupes faciles à manier et pouvant être examinées sur leurs deux faces — mais encore au point de vue de la localisation des lésions, car il est facile de dessiner ces dernières sur la lame de verre.

Méthodes de colo ration.

6. Méthodes de coloration. — Les méthodes de coloration varient suivant les éléments du système nerveux que l'on veut étudier. Les unes coloration des sont applicables à l'étude des fibres à myéline, d'autres à l'étude des cellules nerveuses et de leurs prolongements cylindre-axiles ou protoplasmiques, d'autres enfin à la névroglie, au tissu conjonctif et aux vaisseaux.

Méthode de wei- A. coloration des fibres A myéline. — Méthodes de Weigert et de Pal. — Ces méthodes ne sont applicables qu'aux pièces durcies dans les bichromates.

Méthode de Weigert. — Les coupes, munies de leur papier numéroté, doivent être placées dans la solution colorante sans subir le contact de l'eau ; aussi est-il nécessaire, lorsqu'on emploie le microtome de Gudden, de

ïort.

les déshydrater pendant une heure dans de l'alcool à 90°. Elles sont ensuite plongées dans la solution suivante :

Hématoxyline 1 gramme.

Alcool absolu 10 —

Eau distillée 90 —

Le liquide est porté à l'ébullilion dans une capsule de porcelaine, puis, lorsqu'il est refroidi, on y ajoute 1 centimètre cube d'une solution de carbonate de lithine à 1/100.

Les coupes doivent séjourner en hiver vingt-quatre heures dans le coloration des liquide, un peu moins en été, ou une demi-heure seulement dans une méSe^'eTVeï étuve à 40°. Les colorations lentes de dix-huit à vingt-quatre heures nous Bert paraissent préférables. Les coupes prennent dans cette solution une coloration d'un noir intense; elle sont soumises ensuite à l'action d'un liquide décolorant composé comme suit :

Borax 2 grammes.

Feri'i-cyanure de potassium 2 gr. 50.

Eau distillée 100 grammes.

Cette solution est en général beaucoup trop forte, surtout lorsqu'on Décoloration des

,. , ,. *i*ia, ir- ,i*i coupes avec la mé-

pratique des coupes en séries, coupes qui doivent être colorées et decolo- thode de weigert. rées en grand nombre à la fois, car ces coupes étant plus ou moins superposées les unes aux autres, certaines d'entre elles sont déjà trop décolorées, quand d'autres sont encore complètement noires. Nous employons la solution précédente étendue de quatre fois son volume d'eau, et mettons trois, quatre et même cinq jours à décolorer nos coupes, en changeant le liquide chaque jour, et en l'employant en grandes quantités, un litre par exemple, pour une trentaine de coupes vertico-transversales d'un hémisphère cérébral. Nous sommes certains de la sorte de ne jamais obtenir de coupes trop décolorées.

Lorsque les coupes sont suffisamment décolorées, elles présentent une apparence spéciale, qui constitue, l'état dit de différenciation sur lequel est basée la méthode de Weigert. Toutes les fibres à myéline ont pris une coloration d'un noir bleuâtre, tandis que la substance grise ainsi que la névroglie, les vaisseaux et les cylindres-axes, se sont teintés en jaune tirant plus ou moins sur le brun.

Pour être montées, les coupes doivent subir, au sortir de la solution Les coupes, une fois

, , , , , , . . , l'état de différencia-

decolorante, les préparations suivantes : tion obtenu, sont ia-

1° Séjour prolongé dans l'eau distillée. Nous les y laissons en général vées ,à le.au disîlllée

J -T o J D pendant plusieurs

trois à quatre jours en renouvelant l'eau chaque jour. Nous sommes arrivés j°urs par ce procédé, à obtenir des coupes se conservant indéfiniment sans noircir jamais.

2° Déshydratation par un séjour de deux heures dans l'alcool à 90° et d'une demi-heure dans l'alcool absolu.

Déshydratation et l}° Éclaircissement des coupes à l'aide du liquide suivant dont nous

éclaircissement des . i p , . u- . .

00Upes. devons La lormule a \\ eigert :

Acide phénique pur (neigeux) I partie.

Xylol ii parties.

Ce mélange doit être contenu dans un llacon bouché à l'émeri, et dans le fond duquel on verse du sulfate de cuivre porphyrisé et anhydre, en quantité suffisante pour former au fond du ilacon une couche de 2 centimètres de hauteur. On aura soin de renouveler le sulfate de cuivre dès qu'il présentera la moindre trace de coloration bleuâtre, indiquant qu'il commence à s'hydrater.

Lo xyioi phénique Le liquide proposé par Weigert, et dont l'emploi est préférable aux do weigert no dis- ancjens procédés d'éclaircissement des coupes — car il ne dissout pas le

sout pas lo collodion. t r r

collodion, — ne présente pas seulement l'avantage d'éclaircir la préparation, mais il exerce encore sur cette dernière une action déshydratante. On en fait usage de la manière suivante : On verse une certaine quantité du liquide dans une assiette et on y plonge les coupes au sortir de l'alcool absolu; l'éclaircissement est pour ainsi dire instantané. Emploi de la créo- Le mélange de xylol et d'acide phénique de Weigert, est applicable gïroHe^deTerga- également aux préparations traitées par la méthode de Pal ou par le motc, pour éciaircir carmin, niais décolore celles qui sont traitées par les couleurs d'aniline.

les coupes non im- . . L l . .

prégnées do coiio- Pour eclaircir ces dernières, on se servira d un mélange de xylol et d huile d'aniline. Pour les coupes provenant de pièces non imprégnées au collodion, on peut se servir comme réactif éclaircissant, de créosote, d'essence de girolle, ou de bergamote.

Montage des cou- Une fois éclaircies, les coupes sont montées dans du baume de Canada

doSca1iada.1C aUme dissous dans le xylol, recouvertes d'une lamelle et conservées à l'abri de la lumière. Pour les grandes coupes des hémisphères on ne peut, à cause du prix de revient, recouvrir les coupes d'une série entière avec des lames minces, ce qui du reste n'est nullement nécessaire. On se bornera à en monter une avec une lame mince, tous les dix ou tous les vingt numéros et les autres seront recouvertes d'une plaque de verre ordinaire.

Pendant ces différentes manipulations — depuis la coloration jusqu'au montage, — la coupe reste toujours appliquée sur sa feuille de papier filtre, qui ne la quitte que lorsqu'elle est déposée sur la lame de verre. S'il s'agit de coupes sériées et partant numérotées au crayon, le numéro réapparaît en même temps que la préparation se décolore. On l'inscrit aussitôt sur la préparation.

Emploi do la mé- Cette méthode de Weigert — applicable aux nerfs périphériques comme

pômMétudoXdosed'!- aux centres nerveux, — constitue leplus grand des progrès accomplis dans

générescencossecon- ia technique histologique, pour l'étude du trajet des fibres nerveuses. Son emploi en anatomie pathologique n'est pas moins utile, et son importance est capitale pour l'étude des lésions de la substance blanche — dégénérescences, etc.

La coloration noir bleuâtre, que prennent à l'état normal les tubes à coloration <iiff<smyéline, varie d'intensité suivant tel ou tel système de libres. C'est ainsi 0caux dans u mien particulier que dans le cerveau, les radiations optiques de Gratiolet, thodo do Woisertprennent sous son influence une coloration beaucoup moins foncée que le faisceau longitudinal inférieur, et ces différences d'intensité de coloration sont d'une très grande importance en anatomie normale, car elles nous permettent de suivre tel ou tel système de fibres, au milieu d'entrecroisements plus ou moins compliqués.

Pour obtenir une différenciation encore plus parfaite des fibres à myé- Emploi du sousliue, Weigert a modifié sa première méthode, et imbibe d'un set de cuivre dans la méthode do la pièce avant de la couper. S'il s'agit d'une pièce de petit volume — weigert. moelle, bulbe, protubérance, — la pièce imbibée de collodion et fixée sur son support, est placée dans une solution saturée d'acétate neutre de cuivre, à laquelle on ajoute un volume égal d'eau distillée, puis mise àl'étuve à 40° pendantunedemi-heure. Ccprocédé,quia le désavantage de racornir la pièce, n'est applicable qu'à de petits fragments de substance nerveuse, et ne peut être employé pour des coupes d'hémisphère entier. Il n'est du reste pas nécessaire de traiter la pièce par le cuivre avant de la couper, car on obtient d'aussi bons résultats — et sans racornir la pièce, — en plaçant les coupes dans la solution cuprique en question, soit une demi-heure à l'étuve à 40°, soit vingt-quatre heures à la température ambiante. Nous ferons, du lc cuivrage dos

,, .. , . , . , . , . pièces n'est pas né-

reste. remarquer que 1 action du cuivre n est pas nécessaire pour obtenir cessaire pour obtenuune bonne différenciation, à condition que les pièces aient séjourné long- uiafonTpL^mc^ temps dans le bichromate. Aucune des préparations que nous avons faites thode de weigen. pour l'ouvrage que nous publions ici n'a été traitée par le cuivre.

Méthode de Pal. — Cette méthode n'est qu'une variante de la précé- coloration des fidélité. Les coupes sont placées dans une solution d'hématoxyline, préparée i" méthode Cdënpaipai de la même manière que dans la méthode de Weigert. Si la pièce dont elles proviennent n'est pas très imprégnée par les bichromates, il sera bon de placer les coupes pendant quelques heures dans une solution de bichromate de potasse, avant de tes colorer. Elles resteront dans le liquide colorant vingt-quatre heures, ou deux heures seulement si on fait usage de l'étuve à 40°. Au sortir de l'hématoxyline les coupes sont lavées dans l'eau distillée, puis placées dans la solution suivante :

Eau distillée 400 grammes.

Permanganate de potasse 1 gr. —

Elles séjo'urnent dans cette solution un temps très court, d'une demiminute à cinq minutes, et en sont retirées, lorsque la substance grise se détache nettement en brun sur le reste de la coupe qui est noir. Elles sont de nouveau lavées à l'eau distillée et placées dans la solution suivante :

Acide oxalique pur 1 gramme.

Sulfite de potasse ou de soude. ... 1 — Eau distillée . . 200 —

Il est préférable, du reste, d'avoir dans des flacons séparés, des solutions d'acide oxalique et de sulfure de potassium, à 1 p. 100, et de mélanger par parties égales, les deux liquides au moment d'en faire usage. Décoloration des Les coupes séjournent dans ce liquide un très petit nombre de minutes

thoLdePai. d (1/2 à 3), jusqu'à ce que leur coloration soit devenue bleu grisâtre. Si ce changement de coloration ne se produit pas, il faut de nouveau, et après avoir lavé les coupes à l'eau distillée, les placer dans la solution de permanganate, les laver de nouveau et les remettre dans la solution décolorante. Parfois on est obligé de répéter plusieurs fois de suite la même manœuvre. Lorsque l'état de différenciation est atteint, les coupes sont lavées longuement à l'eau distillée et traitées, pour être monlées, par les mêmes procédés que dans la méthode de Weigert, — alcool, xylol phéniqué. — Les préparations obtenues par la méthode de Pal diffèrent de celles traitées par la méthode de Weigert, par ce fait que tout ce qui n'est pas libre à myéline y est complètement décoloré — névroglie, cellules, vaisseaux, etc., — et que partant on peut colorer ces éléments, soit par le carmin ammoniacal ou le picro-carmin, le rouge de Magdala, l'éosine et surtout par le carmin acétique ou aluné. Dans la méthode de Weigert ces différents procédés de coloration ne donnent pas de bons résultats. Avantages respec- L'une et l'autre de ces méthodes devront toujours être employées en

vveïg'ert et de Pal. ° anatomie normale. La méthode de Pal l'emporte sur celle de Weigert pour la coloration des très fines fibres à myéline, mais nous parait être un peu inférieure à cette dernière pour différencierles faisceaux les uns des autres. Avec la méthode de Weigert on obtient dans les faisceaux de l'encéphale, une gamme de colorations allant, suivant les faisceaux, du bleu noir intense au brun noirâtre, plus variée, du moins d'après notre expérience personnelle, qu'avec la méthode de Pal.

En anatomie pathologique les deux méthodes doivent être généralement employées, en particulier pour tout ce qui concerne les lésions de la substance blanche, — dégénérescences secondaires, scléroses systématisées ou diffuses, scléroses en plaques, etc.

Modifications an- Modification de la méthode de Weigert d'après Vassale. — Ce procédé, do weigen par vas- qui a pour but de simplifier la méthode de Weigert et de la rendre d'une exécution plus rapide, consiste à mettre les coupes pendant trois à quatre minutes dans une solution très chaude d'hématoxyline à I p. 100. Elles sont ensuite lavées à l'eau distillée, puis plongées pendant trois à quatre minutes dans une solution saturée d'acétate neutre de cuivre. Sorties de la solution cuprique, elles sont lavées de nouveau et décolorées dans la solution de Weigert (ferri-cyanure et borax).

11. COLORATION DES CELLULES NERVEUSES ET DE LEURS PROLONGEMENTS. COLORATION DE LA NEVROGLIE, DU TISSU CONJONCTIF ET DES VAISSEAUX. —

Carmin, picro-carminate d ammoniaque , hématoxyline. Couleurs d'aniline. Imprégnations métalliques.

sale.

min d'après Ranvier,

a. Carmin. — Depuis que Gerlach a introduit le carmin dans la technique, bien des formules ont été indiquées. Nous employons le plus habi- coloration au car (licitement la formule de Ranvier. Un gramme de carmin pulvérisé, est broyé dans un mortier de porcelaine avec quelques gouttes d'eau, auxquelles on ajoute un gramme d'ammoniaque. Lorsque le carmin est dissous, on ajoute 100 centimètres cubes d'eau distillée, puis on chauffe la solution au bainmarie pour enlever l'excès d'ammoniaque.

Les coupes sont placées dans un cristallisoir contenant de l'eau distillée, à laquelle on a ajouté de la solution précédente jusqu'à coloration fleur de pécher ; elles y restent vingt-quatre heures. Ce procédé dit de coloration, lente est celui qui donne les meilleurs résultats. Avec cette méthode — coloration lente dans une solution faible, — les cellules et leurs prolongements, le cylindre-axe des tubes nerveux, les septa conjonctifs, les tuniques des vaisseaux, les noyaux apparaissent colorés en rouge plus ou moins vif, et la charpente névroglique en rose pâle. Les gaines de myéline doivent rester blanches ou légèrement jaunes (bichromate). On peut rendre la coloration au carmin plus rapide, en plaçant sous le couvercle du récipient une goutte d'acide acétique, ou bien encore en chauffant au bain-marie.

Les coupes, une fois colorées, seront lavées à l'eau distillée, déshydratées par l'alcool ordinaire et l'alcool absolu, et éclaircies dans de l'essence de girofle — si la pièce dont elles proviennent n'a pas été imprégnée au collodion. — Il est à remarquer que les colorations au carmin donnent de plus beaux résultats, si la pièce n'a pas été soumise à l'action de l'alcool. Aussi, quand on veut avoir de belles colorations carminées des cellules et de leurs prolongements, est-il préférable de couper la pièce sous l'eau, après l'avoir lavée pendant un certain temps pour la débarrasser de l'excès de bichromate et sans la déshydrater. Au lieu de carmin, on peut employer le coloration au Pipicro-carmin de Ranvier à 1 p. 100. Conservées à l'abri de la lumière, les ^armin de Rancoupes coloriées au carmin se maintiennent indéfiniment.

Si on désire obtenir une coloration intense des noyaux, on emploie le carmin borate, aluné ou lithiné.

Carmin-borax [Greenacher) : Carmin-borax de

Greenacher.

Carmin 0 gr. 50

Borax 2 grammes.

Eau distillée 100 —

Chauffer jusqu'à ébullitiou en agitant le mélange, et en ajoutant goutte à goutte de l'acide acétique dilué (b p. 100), jusqu'à ce que le mélange vire de la coloration rougebleu qu'il avait au début, à celle du carmin ammoniacal. Laisser reposer le liquide pendant vingt-quatre heures, décanter et filtrer.

On colore les coupes de la manière suivante : On les lave dans l'eau distillée, et on les plonge dans la solution colorante, où elles prennent très rapidement une coloration intense et diffuse. On les traite ensuite par les procédés que voici :

1° Séjour dans un cristallisoir contenant la solution suivante :

Acide chlorhydrique 1 gramme.

Alcool 70 —

Eau distillée 30 —

Il se produit une décoloration rapide qu'il faut surveiller.

2° Lavage à l'eau distillée. 3° Déshydratation par l'alcool absolu, éclaircissement et montage dans le baume de Canada. Avec cette méthode les noyaux présentent une coloration intense, mais les cellules sont modifiées par l'acide chlorhydrique. La coloration est en outre peu stable.

Carmin ainno de Carmin aluné (Greenacher) :

Greonachci*.

Carmin 1 gramme.

Solution d'alun à 5 p. 100. . . 100 centim. cubes. Chauffer et faire bouillir pendant une demi-heure. Filtrer après refroidissement.

On place les coupes dans cette solution, après les avoir préalablement lavées à l'eau distillée. Avec le carmin aluné,on n'a pas à craindre de surcolorations.

carmin uthinc <ie Carmin lithiné de Or/h. — On fait dissoudre 2 parties et demie de carmin, dans 97 parties et demie de solution saturée de carbonate de lithium. Les coupes plongées dans le liquide colorant prennent une coloration diffuse, et pour localiser cette dernière sur les noyaux, on lave les coupes dans la même solution que lorsque l'on emploie le carmin borate (alcool, acide chlorhydrique et eau).

Lorsque les coupes traitées par le carmin aluné ou lithiné doivent être montées dans le baume de Canada — et c'est le cas ordinaire, — il y a avantage à les traiter au sortir du bain colorant par le mélange suivant :

Alcool absolu 70 centim. cubes.

Eau picriquée (saturée a froid). . 30 —

Acide chlorhydrique 10 gouttes.

Ce mélange produit une très bonne différenciation et commence la déshydratation, coloration de la né- Il est souvent nécessaire, en particulier dans les cas pathologiques, vroelie- d'obtenir une bonne coloration de la névroglie. Jusqu'ici, nous ne pos-

sédons pas de technique qui permette de colorer exclusivement la névrocoiorationdeiand- glie, et dans les procédés de coloration au carmin que nous venons d'indiquer, les fibrilles de la névroglie n'apparaissent pas nettement colorées.

on h.

vroglie par le car-

min

coloration ou Par le procédé de la colora/ion en masse de Forel, procédé employé par Ranvier pour étudier la névroglie de la moelle épinière, et qui donne en outre de très bons résultats pour la coloration des éléments nerveux, on obtient une très belle coloration des fibrilles de la névroglie. Dans ce procédé on opère de la manière suivante : De petits fragments de substance ner-

mio pathologique do la méthode do coloration en masse de Forel.

veuse, durcis dans les bichromates, sont lavés plusieurs jours dans de l'eau distillée renouvelée chaque jour. Lorsque l'eau qui les contient ne se colore plus par les sels de chrome, on place chacun de ces fragments pendant trois à quatre semaines dans de petits llacons bien bouchés, et contenant du carmin ou du picro-carmin à 1 p. 100. Au boutde ce temps on déshydrate les pièces par l'alcool et on les inclut soit dans la paraffine, soit dans le collodion, mais de préférence dans la première de ces substances. Les coupes pratiquées au microtome, sont ensuite déshydratées et éclaircies par les procédés ordinaires, puis montées dans le baume de Canada. Par ce procédé, on obtient des préparations dans lesquelles les fibrilles de la névroglie apparaissent très nettement et très intensivement colorées, ainsi que les cellules nerveuses et les cylindre-axes.

En anatomie pathologique, il est souvent utile de pouvoir différencier Emploi en anatonettement, dans le tissu de soutènement des centres nerveux, le tissu conjonctif proprement dit de la névroglie. Sur les dissociations pratiquées à l'état frais, la différence est facile à établir par les caractères morphologiques, d'une part, par l'action de l'acide acétique qui gontle et dissout le tissu conjonctif sans altérer la névroglie, d'autre part. Sur les pièces durcies par les bichromates et colorées par la méthode de Forel, on distingue en général très facilement à l'examen histologique, après action du carmin ou picro-carmin, les fibrilles de la névroglie d'avec les fibres du tissu conjonctif. Dans certains cas cependant il est nécessaire, pour établir nettement les différences, d'avoir recours au procédé de Malassez et Chaslin. procédé de Maïas- Dans ce procédé, les coupes sont placées avant toute espèce de coloration, s dans une solution de potasse à40 p. 100 où elles séjournent un temps variant de dix à quinze minutes. Elles sont ensuite soigneusement lavées à l'eau distillée, colorées à l'aide du carmin ou du picro-carmin, et soumises à l'action de l'acide acétique concentré. Lavées de nouveau très complètement, elles sont montées directement dans la glycérine ou bien dans le baume de Canada, après déshydratation et éclaircissement. Au microscope, tout ce qui appartient au tissu conjonctif apparaît gonflé et décoloré, tandis que les fibrilles névrogliques n'ont subi aucune espèce de modification. Le procédé de Malassez et Chaslin a été employé par Chaslin dans ses études sur la sclérose cérébrale (1889), par Letulle et l'un de nous, puis par Achard dans des recherches sur les scléroses de la moelle épinière (1890).

Eématoxyline. — Une des méthodes qui permet le mieux d'apprécier iiématoxyiine aiu-

-.,,.,... , . , r . ,. née. Son emploi pour

1 état des tissus annexes au parenchyme nerveux, (méninges, tissu con- ia coloration des jonctif, névroglie, vaisseaux), et qui rend de grands services en anatomie pathologique, c'est l'emploi de l'hématoxyline alunée comme colorant cytologique.

Les tissus nerveux étant durcis dans les bichromates, les composés colorants à base de carmin ont assez peu d'affinité pour les noyaux qui se colorent au contraire très bien par l'hématoxyline. On peut ainsi déceler les infiltrations embryonnaires méningées ou périvasculaires et la disposition de tous les éléments nucléés.

noyaux.

La solution colorante qui nous paraît la plus favorable pour ce genre d'études est l'hématoxyline à l'alun, composée à peu près selon la formule indiquée par Boehmer.

< >n prépare séparément les deux solutions mères suivantes :

lrc solution :

Hématoxyline cristallisée. ... 1 gramme. Alcool à 90° i'ô centim. cubes.

2e solution :

Alun purifié 1 gramme.

Eau distillée 300 centim. cubes.

Ces deux solutions, conservées isolément, gardent indéfiniment leurs propriétés. Elles serviront à préparer le mélange colorant, qui devra être fait huit à dix jours à l'avance, car ce n'est qu'au bout de ce temps que ce mélange fournit de bonnes élections colorantes.

On prend 50 ce. de la solution alunée à laquelle on ajoute 3 ce. de lo solution alcoolique d'hématoxyline.

Le mélange exposé à l'air et à la lumière dans un vase couvert, se fonce peu à peu ; on le filtre au bout de huit jours et il est alors bon à employer. Il conserve ses propriétés pendant un à deux mois seulement.

Les coupes faites sur des pièces incluses dans le collodion, sont mises dans le mélange colorant pendant une à deux minutes ; on doit les retirer avant qu'elles aient pris une teinte foncée. En plaçant de temps en temps la coupe sous l'objectif du microscope, on constate que les noyaux prennent la coloration violette avant que le reste de la coupe se teinte. Si l'on avait dépassé ce point, on pourrait débarrasser la coupe de l'excès de matière colorante, en la lavant dans de l'eau distillée additionnée de quelques gouttes d'acide acétique. Quoi qu'il en soit, les coupes seront en dernier lieu lavées à l'eau distillée, puis déshydratées et montées d'après les procédés ordinaires.

Double coloration Sur les coupes de tissu nerveux ainsi traitées, les noyaux sont colorés réosinemat°Xymett en vi°let, et le tissu nerveux présente une teinte légèrement grisâtre assez peu favorable à l'examen. Pour obtenir plus de netteté, on colore le fond en plaçant les coupes dans une solution aqueuse d'éosine à 5 ou 10 p. 100. Double coloration Le mieux est de faire la double coloration avec le carmin, et dans ce cas, on devra de préférence colorer d'abord par le carmin avant d'employer l'hématoxyline. Les coupes seront placées pendant vingt-quatre heures dans un bain abondant mais faible de carmin ou de picro-carmin, (quelques gouttes de l'une ou de l'autre des solutions dans un demi-verre d'eau).

Après cette première coloration, la plupart des éléments de la coupe, tissu conjonctif, vaisseaux, tissu scléreux, cylindre-axes, cellules nerveuses, sont déjà différenciés. On y joindra la coloration violette des noyaux par le bain hématoxylique dont l'action devra être très discrète,

par le carmin et l'hé matoxvlinc.

Couleurs d'aniline.

Méthodo do Jelgorsma.

dans la crainte de modifier trop profondément la teinte carminée primitive. Les coupes qui auront été préalablement traitées par le picro-carmin dilué seront lavées avec beaucoup de ménagement avant l'imprégnation hématoxylique, pour respecter l'acide picrique qui s'est fixé sur la myéline. On pourra ainsi obtenir une triple coloration.

Les coupes colorées par Thématoxyline alunée ou par l'éosine se conservent mal dans la glycérine même neutre; montées dans le baume, après déshydratation et éclaircissement dans le xylol phéniqué ou l'essence de girofle, elles possèdent au contraire une grande fixité.

b. Couleurs d'aniline. — Méthode de Jelgersma. — Cette méthode, basée sur l'emploi du « blue-black », fournit des préparations qui se conservent très longtemps. L'aniline blue-black, ne colore presque pas la névroglie et le tissu conjonctif et imprègne particulièrement les cellules, leur noyau et leur nucléole, ainsi que le cylindre-axe. Cette méthode a été recommandée par quelques auteurs, pour l'étude des cellules pyramidales de l'écorce, et pour celle des cellules de Purkinje du cervelet. En anatomie pathologique c'est aussi une bonne méthode pour l'étude des altérations cellulaires. L'aniline « blue-black » s'emploie en solutions aqueuses; on se sert de préférence de solutions faibles, au 1/2000° par exemple. Les coupes séjournent douze heures dans la solution puis sont traitées comme des coupes colorées au carmin.

Schmaus a modifié la méthode de Jelgersma. Il emploie une solution procédé de schmaus alcoolique de blue-black à 1/4 p. 100, et y ajoute une certaine quantité d'acide picrique. Les coupes sont placées dans cette solution après lavage préalable à l'eau distillée, et y séjournent une heure. Elles sont de nouveau lavées à l'eau distillée, puis déshydratées, etc. Avec le procédé de Schmaus on peut colorer des coupes traitées par la méthode de Weigert.

Nigrosine. — Cette méthode employée par Luys et par Gaule, fournit les mêmes résultats que la méthode au blue-black, dont elle ne diffère que par la nature de la coloration qui est noire au lieu d'être bleu foncé. Mercier recommande la formule suivante :

Méthode à la nigrosine de Luys, Gaule, Mercier.

Nigrosine 1 gramme.

Eau distillée 100 —

Les coupes séjournent vingt-quatre heures dans cette solution, puis sont lavées successivement à l'eau distillée et à l'eau acidifiée (30 gouttes d'acide acétique pour 500 ce. d'eau distillée). Déshydratation et éclaircissement suivant les procédés ordinaires.

Lorsqu'on se propose de colorer surtout les noyaux par une couleur d'aniline, on emploie le brun de Bismarck à 1 p. 300

Méthode de Nissl. — Cette méthode est très-importante en histologie normale et pathologique. Il faut, pour qu'elle donne de bons résultats, avoir des pièces tout à fait fraîches, que l'on divise en fragments n'ayant pas plus de 4 à 5 millimètres de côté. On place ces fragments dans de l'alcool

Coloration des noyaux par le brun de Bismarck.

Méthode de Nissl à la fuchsine.

à 70 p. 1 00 pondant deux jours, puis dans l'alcool absolu pendant cinq jours. Les coupes une fois pratiquées sont plongées dans une solution saturée de fuchsine, chaque coupe étant colorée à part dans un verre de montre. On chauffe ensuite jusqu'à dégagement de vapeurs. On peut colorer à la température ordinaire, en laissant les coupes 24 heures dans la fuchsine. La coupe est ensuite placée pendant une ou deux minutes dans de l'alcool absolu, puis déposée sur une lame porte-objet et arrosée d'essence de girolle, jusqu'à ce qu'elle ne rende plus de matière colorante, ce qui s'obtient en égouttanl la coupe, et en renouvelant au fur et à mesure l'essence de girolle. On la baigne ensuite dans le xylol et on la monte dans le baume de Canada. Avec cette méthode, on obtient une bonne coloration des cellules nerveuses et de leurs noyaux, ainsi que des cellules de la névroglie et des vaisseaux. Les prolongements cellulaires sont colorés moins fortement que les cellules. La myéline reste incolore. Cette méthode est en outre excellente pour l'étude du protoplasma cellulaire.

Méthode cTEhriicu Méthode d'Ehrlich au blnt de méthylène. — Dans cette méthode, les employée sur les ani- nerfs sont colorés sur l'animal vivant, en injectant le bleu de méthylène dans le système vasculaire. Chez la grenouille, il suffit, pour obtenir la coloration cherchée, d'injecter la solution colorante dans le sac lymphatique dorsal. La méthode d'Ehrlich donne de précieux résultats, surtout

Procédé de Dogici pour l'étude du système nerveux périphérique. Dogiel et Riese l'emploient de la manière suivante : On injecte dans une veine de l'animal vivant une grande quantité de la solution suivante : Bleu de méthylène, 4 grammes ; Chlorure de sodium, 0;',6; Eau distillée, 100 grammes. Le plus souvent l'animal succombe après l'injection; dans le cas contraire, on le sacrifie aussitôt. L'animal est rapidement ouvert et on expose à l'air les organes que l'on veut examiner, jusqu'à ce qu'une teinte bleuâtre se produise. On fixe la coloration qui est instable avec une solution aqueuse concentrée de picrate d'ammoniaque faite à froid. On coupe avec le microtome à congélation. Certaines parties telles que la vessie, le péritoine, la langue, peuvent être examinées dans un mélange à parties égales de glycérine et d'eau, auquel on ajoute une trace de picrate d'ammoniaque.

Procédé do Rct- Hetzius, appliquant cette méthode à l'étude des terminaisons nerveuses

zius pour l'emploi du , , T , ,, , . . , , . , . ,

bicu de méthylène chez les Invertébrés, injecte dans le corps de ces derniers, une assez grande chez les invertébrés. quantj[té d'une solution à 0,2 p. 100 de méthylène, et au bout de quelques minutes met à nu le système nerveux en enlevant les enveloppes. 11 opère sur un assez grand nombre d'animaux à la fois, et les place dans un cristallisoir permettant l'entrée de l'air, et en évitant la dessication. Il les y laisse un nombre d'heures variable. Au bout d'une heure, il commence à examiner quelques ganglions et arrive, par tâtonnements, à reconnaître au bout de combien de temps la coloration est la plus nette, imprégnations mé- r. Méthodes d 'imprégnations métalliques. — (Centres nerveux et nerfs périphériques). Aride, osmique, Chlorure d'or, Nitrate d'argent, Sublimé. Acide osmiquo. 1" Acide osmique. — ■ Introduit dans la technique hislologique par Max

Schultze, qui lui reconnut la propriété de colorer en noir les graisses et la

myéline, l'acide osmique a été employé surtout par Ranvier. L'acide osmique peut être usité comme agent fixateur, comme agent durcissant et colorant tout à la fois, ou seulement comme agent colorant. Nous renvoyons au Traité d'Histologie de Ranvier, pour tout ce qui concerne l'emploi de l'acide osmique comme agent fixateur des éléments nerveux à l'état normal. A l'état pathologique, l'acide osmique en solution, est employé avec avantage comme fixateur, dans les dissociations à l'état frais, ainsi que pour étudier les cellules nerveuses. On expose la préparation pendant quelque temps, au contact des vapeurs d'une solution d'acide osmique à 1 p. 100, en chauffant le flacon au bain-marie.

Comme agent durcissant et colorant tout à la fois, l'acide osmique sert à étudier, à l'aide de coupes, des fragments du système nerveux central ou périphérique.

Méthode d'Exner. — Les pièces provenant de la moelle ou du cerveau, Méthode d'Exnor, doivent être prises immédiatement après la mort, et coupées en morceaux ayant au maximum 1 cent, d'épaisseur. On les met dans une solution d'acide osmique à 1 p. 100, suffisamment abondante pour que son volume soit douze ou quinze fois plus considérable que celui des fragments. On change le liquide dès qu'il prend une coloration noire. Au bout de cinq ou six jours, on lave les fragments à l'eau distillée, et on les coupe directement, après les avoir collés sur uu morceau de bois ou de liège, ou après les avoir imprégnés par le collodion ou la paraffine. Les coupes sont lavées à l'eau distillée, puis montées directement dans la glycérine ou dans le baume de Canada, après déshydratation et éclaircissement. Les préparations ne se conservent pas.

Bellonci a modifié de la manière suivante la méthode d'Exner : la pièce, procédé deBeiionoi. qui doit être également de petit volume, est durcie pendant 14 à 20 heures dans une solution d'acide osmique à 1 p. 100. On pratique les coupes à la main, à l'aide d'un rasoir imbibé d'alcool. Les coupes étant lavées dans de l'eau distillée, puis plongées pendant 3 heures dans de l'alcool à 80°, sont traitées de nouveau par l'eau distillée, puis placées sur la lame porte-objet. On recouvre d'une lamelle sous laquelle on instille quelques gouttes d'ammoniaque. Par ce procédé, on obtient une coupe extrêmement transparente et dans laquelle les fibres à myéline, d'un noir intense, se détachent avec une grande netteté.

L'étude des troncs nerveux périphériques, à l'aide découpes pratiquées Examen des nerfs sur les nerfs durcis dans l'acide osmique donne d'excellents résultats. On LTadde^smique! procède de la manière suivante : A l'aide d'un scalpel très tranchant, ou employé â ia fois

* i- comme durcissant et

de préférence à l'aide d'un rasoir bien affilé, on sectionne, dans les troncs comme colorant. nerveux que l'on veut examiner, des fragments de 1 cent, de longueur, comprenant toute l'épaisseur du nerf et bien affrontés sur chacune de leurs faces. Ces fragments sont plongés et maintenus suspendus, dans une solution d'acide osmique à 1 p. 100 dans laquelle ils séjournent, suivant leur volume, de 24 à 48 heures. La solution d'acide osmique est maintenue à l'abri de la lumière. Au sortir de la solution, ces fragments sont inclus

Iûclusion à la paraffine des tronçons de nerfs durcis et colorés par l'acide osmique.

Autres procédés pour couper les tronçons de nerfs traités par l'acide osmique.

Importance de cette méthode en anatomie pathologique.

Etude des nerfs périphériques par le procédé de la dissociation après coloi-ation à l'acide osmique.

Méthode de Ranvier

dans la paraffine par la méthode ordinaire, puis coupés au microtome et à sec. Les coupes sont placées sur une lame porte-objet, imbibées de xylol, montées dans le baume de Canada et recouvertes d'une lamelle.

Ce procédé est un peu long et méticuleux. Nous nous servons d'habitude de l'un ou de l'autre des procédés suivants : 1° Au sortir de l'acide osmique, les tronçons de nerf sont montés dans du sureau et coupés avec le microtome à main de Ranvier; 2° Après action de l'acide osmique, les tronçons sont inclus dans le collodion par les mêmes procédés que pour les centres nerveux. Dans les deux cas, les coupes, avant d'être montées dans le baume de Canada, sont traitées comme les coupes du système nerveux central. Dans les deux cas, enfin, au sortir de l'acide osmique et avant d'être préparés pour être coupés, les fragments de nerf devront être lavés pendant plusieurs heures dans l'eau distillée, pour éviter que les préparations ne noircissent par la suite.

Le tronçon de nerf étant coupé perpendiculairement à sa longueur, on obtient ainsi de très belles images, où toutes les fibres à myéline apparaissent sous forme de petits cercles fortement colorés en noir, tandis que le reste de la coupe, tissu conjonctif, vaisseaux, a pris une coloration grisâtre. En anatomie pathologique, cette méthode est très précieuse, car elle permet d'étudier des nerfs cinq ou six jours après l'autopsie.

L'acide osmique est enfin journellement employé pour l'étude des nerfs périphériques en solution à 1 p. 100 (Ranvier) comme agent à la fois fixateur et colorant. On procède de la manière suivante sur le nerf frais : Après avoir fendu la gaine lamelleuse, et dissocié le nerf avec des aiguilles dans une solution d'acide osmique à 1 p. 100, où il séjourne quelques heures, on le colore ensuite au picro-carmin et on monte la préparation dans la glycérine. Pour éviter le ratatinement du nerf, il est bon de fixer chaque extrémité sur une planchette de liège. L'étude des nerfs par la méthode précédente (dissociation, acide osmique, etc.), rend d'inappréciables services en anatomie pathologique, mais elle n'est guère applicable aux gros troncs nerveux de l'homme, dont la dissociation est des plus délicates et difficiles. Elle est surtout utilisable pour les troncs nerveux de petit calibre — nerfs musculaires, rameaux cutanés. — Les gros troncs doivent de préférence être examinés à l'aide de coupes transversales, après durcissement dans l'acide osmique.

Voici la méthode que nous employons dans nos recherches sur les névrites périphériques : On prend, aussitôt que possible après la mort, les nerfs cutanés et musculaires dans les régions où on veut les étudier. Il est préférable, au point de vue de la facilité de la dissociation, de ne pas prendre de nerfs d'un diamètre supérieur à celui d'une aiguille à tricoter d'une moyenne grosseur. La dissociation, pratiquée dans l'eau distillée et non dans la solution d'acide osmique, — ■ dont les vapeurs sont trop irritantes, — est faite grossièrement, mais suffisamment pour que l'acide osmique puisse pénétrer dans toute l'épaisseur du nerf. Le tronc nerveux est placé ensuite pendant vingt-quatre heures, dans une solution d'acide

MÉTHODES USITÉES DANS L'ETUDE DES CENTRES NERVEUX. 4o osmique à 1/200, contenue dans un flacon bien bouche'. Au bout de ce Méthodo usitée en

. /» • ■ îj.* 1» a i } f vi anatomio patholo<ri-

temps, Le neri qui a pris une coloration noire d autant plus prononcée qu il qUo pour étudier par est moins altéré, est lavé à plusieurs reprises dans de l'eau distillée, jusqu'à ^^on6 £" laJ,^ ce qu'il soit complètement débarrassé de l'acide osmique, ce qui se recon- périphériques colorés

1 i-ii d 7 i • i ti î à l'aide de l'acido os-

nait au fait qu il a perdu toute trace d odeur de cet acide. Il est alors sou- miguo. mis à une nouvelle dissociation un peu plus complète, puis placé pendant vingt-quatre heures dans du picro-carmin à l p. 100. Au bout de ce temps, il est plongé dans de la glycérine picro-carminée et dissocié complètement, faisceau par faisceau, sur la lame porte-objet, dans quelques gouttes de ce liquide. On recouvre à l'aide d'une lamelle que l'on borde avec du baume, si on désire garder la préparation. Les nerfs traités par celte méthode, peuvent être conservés pendant une quinzaine de jours dans de la glycérine picro-carminée et fournir encore, au bout de ce temps, de très bonnes préparations, avantage qui n'est pas à négliger, lorsque l'on doit examiner un grand nombre de nerfs. La même méthode est applicable à l'étude des racines spinales et de la plupart des nerfs crâniens. Les préparations ainsi obtenues, se conservent très bien pendant plusieurs années (dix ans et même davantage), si on les tient dans l'obscurité.

L'acide osmique, mélangé avec d'autres réactifs, a été employé comme agent durcissant et colorant. Nous ne citerons, parmi ces méthodes, que celle de Marchi et Alghieri, employée surtout pour l'étude des dégénères- Méthode de Marchi cences secondaires de cause expérimentale. Cette méthode donne de bons tudt ^e^dégénéresrésultatsdanslesdégénérescencessecondairesdedaterécente(troissemaines couces do date r"" dans les cas expérimentaux), à une époque par conséquent où les tubes nerveux dégénérés, contiennent encore une assez grande quantité de myéline, réduite en boules et en gouttelettes. Dans les dégénérescences de date un peu ancienne, l'emploi de cette méthode n'est pas indiqué. Dans la méthode de Marchi et Alghieri, la pièce à examiner est réduite en très petits fragments triangulaires ou cubiques, qui sont plongés dans la solution suivante dite de Marchi :

Liquide de Millier . 2 volumes.

Solution d'acide osmique a 1 p. 100. . I —

Les fragments séjournent dans cette solution de cinq, sept à douze jours, puis sont lavés et montés dans Je collodion. Avec cette méthode, les granulations de la myéline contenue dans les tubes malades, apparaissent sous forme de points noirs, et le tissu de soutènement prend une coloration brun clair.

2° Méthode au chlorure d'or de Freud. — Les pièces doivent être durcies Emploi du chlorure dans le liquide de Mùller ou dans le bichromate de potasse seul. Après lavage dans l'eau distillée, on pratique les coupes, que l'on soumet de nouveau à un lavage dans de l'eau distillée. On les place ensuite dans la solution suivante :

cente.

d'or.

Solution de chlorure d or à 10 p. -100. ...)„.. , , .,,,„„ Parties égales.

Alcool a 9o°

Méthode de Freud.

Elles y séjournent cinq à six heures, puis sont lavées de nouveau el très complètement à l'eau distillée. On les sort de l'eau à l'aide d'un morceau de papier-filtre — en ayant soin de ne pas les mettre en contact avec un instrument d'acier, puis on les plonge dans le mélange suivant, récemment préparé :

Potasse caustique 1 partie.

Eau distillée 6 parties.

Le séjour dans ce mélange ne doit pas excéder deux à trois minutes. Les coupes subissent ensuite les manipulations suivantes : 1° Lavage complet à l'eau distillée; 2° séjour pendant cinq à dix minutes dans une solution d'iodure de potassium à 10 p. 100; 3° lavage à l'eau distillée; 4° déshydratation dans l'alcool, éclaircissement dans l'essence de girofle et montage dans le baume de Canada. Avec cette méthode, les fibres nerveuses apparaissent colorées en bleu ou en rouge foncé, parfois même en noir. La méthode de Freud ne donne de bons résultats que sur des pièces très fraîchement recueillies.

Méthode dupson. Méthode au chlorure d'or d'Upson. — Les pièces seront durcies dans le bichromate de potasse de préférence au liquide de Muller; après lavage à l'eau distillée, la pièce est déshydratée dans l'alcool ordinaire puis dans l'alcool à 95" que l'on renouvelle souvent. Le séjour dans l'alcool à 9o° dure jusqu'à ce que la pièce ait pris une coloration verte, ce qui exige en général deux à trois semaines. On coupe ensuite la pièce au microtome, après l'avoir collée sur un liège à l'aide de quelques gouttes de collodion. Les coupes sont placées dans de l'alcool à 80°, et traitées ensuite par l'un ou l'autre des procédés suivants indiqués par Upson :

Procédé A. — Les coupes sont plongées dans la solution suivante :

Chlorure d'or 1 gramme.

Eau distillée 100 grammes.

à laquelle on ajoute (en volume) 2 p. 100 d'acide chlorhydrique, et où elles séjournent deux heures en moyenne. Au sortir de cette solution elles sont lavées dans l'eau distillée, et séjournent une demi-minute dans la solution suivante :

Solution de potasse caustique à 10 p. 100.. o centim. cubes. Ferri-cyanure de potassium une trace.

c'est-à-dire gros comme une tète d'épingle (Mercier). Cette solution doit être préparée chaque fois.

Les coupes sont de nouveau et très complètement lavées à l'eau distillée, plongées pendant une demi-minute dans une solution de potasse caustique

à 10 p. 100, et lavées de nouveau à l'eau distillée. Chacune d'elles est placée une à une dans le liquide de réduction suivant :

Solution d'acide sulfureux. ... 5 centim. cubes. Teinture d'iode à 3 p. 100. ... 10 à lo gouttes. Perchlorure de fer ! goutte.

Elles v rougissent presque instantanément. On verse rapidement le liquide de réduction, et on plonge la cupule et la coupe dans de l'eau distillée. On déshydrate la coupe à l'alcool sur le porte-objet et on l'éclaircit avec l'essence de girofle. On monte dans le baume de Canada.

Procédé B. — Préparer les deux solutions suivantes :

Solution n° 1. — Ajouter à une certaine quantité' de teinture d'iode à 3 p. 100 du chlorure de zinc en quantité suffisante pour que le liquide prenne une coloration jaune. Solution n° 2. — Préparer une solution saturée de phosphate de fer.

Les coupes, une fois pratiquées au microtome, sont placées pendant deux heures dans le liquide suivant :

Solution de chlorure d'or à 1 p. 100 b centim. cubes.

Solution saturée de vanadate d'ammoniaque ... 10 gouttes. Acide chlorhydrique 5 —

Lavage à l'eau distillée, puis action pendant une minute du liquide suivant :

Solution de potasse caustique à 10 p. 100 5 centim. cubes.

Solution de vanadate d'ammoniaque 1 goutte.

Solution de permanganate de potasse à 10 p. 100. 10 gouttes.

Lavage à l'eau distillée. Pendant que la coupe séjourne dans l'eau, préparer le liquide de réduction suivant :

Solution n° 1 (zinc) lo gouttes.

Eau distillée 3 centim. cubes.

Solution n° 2 (fer) 3ào gouttes.

Solution d'acide sulfureux 3 centim. cubes.

L'acide sulfureux doit être ajouté en dernier, car c'est au moment où, par son action, il se forme un précipité, que la coupe doit être plongée dans le liquide réducteur. On termine comme dans le procédé A.

Ces deux procédés d'Upson sont très compliqués, et exigent une assez grande habitude. Mercier recommande l'emploi du procédé A qui est plus simple. Avec la méthode d'Upson on obtient des préparations dans lesquelles les cellules nerveuses et les cylindres-axes sont colorés en rouge.

3" Imprégnations par l'argent, le sublimé. Méthodes de Golgi. — Ces Méthode de Goigi. méthodes sont très importantes, car elles permettent de colorer les cellules avec leurs prolongements, les fibres nerveuses avec leurs ramifications terminales, ainsi que les cellules de lanévroglie.

Gol

La méthode de Golgi au nitrate d'argent varie, suivant que l'on veut examiner des pièces provenant de sujets adultes ou provenant au contraire d'embryons ou de nouveau-nés. De là, trois procéde's, l'un lent, l'autre rapide et le troisième mixte.

Procède- lent <ie Procédé lent de Golgi d'après Stohr et Mercier). — On fait durcir des morceaux d'écorce cérébrale, de cervelet et de moelle épinière avant -2 à 3 centimètres de cùté. dans une grande quantité de liquide de Mùller — de 200 à 500 centimètres cubes. — Après un séjour de plusieurs semaines fo à 6 . pendant lesquelles on renouvellera souvent le liquide, on sort les pièces et on les soumet à l'action des solutions suivantes :

Solution A :

Nitrate d'argent en solution 1 p. 100. . . 2a centim. cube?. Eau distillée 25 —

Solution B :

Nitrate d'argent en solulion 1 p. 100. . . 60 centim. cubes. Eau distillée 20 —

1 Au sortir du liquide de Miiller, les pièces sont placées directement et sans lavage préalable dans un cristallisoir ou une cupule en verre. — On les arrose avec le tiers à peu près de la solution A. — Il se forme de suite un abondant précipité rouge brun et on change le liquide en versant sur les pièces le second tiers de la solution A : le précipité qui se forme est alors moins abondant. — Après avoir vidé de nouveau le cristallisoir du liquide qu'il contient, on y verse le dernier tiers qu'on jette également peu de temps après.

2° Les pièces passent ensuite dans un autre cristallisoir. sur le fond duquel on a placé un petit morceau de papier à filtrer blanc. On les arrose avec la solution B dans laquelle elles séjourneront jusqu'à nouvel ordre. Les pièces peuvent rester très longtemps, plusieurs mois, dans cette solution, sans s'altérer (Mercier).

3° On pratique ensuite les coupes à l'aide d'un rasoir mouillé avec de l'eau distillée, et on coupe des tranches perpendiculaires à la circonférence.

4° La première coupe est opaque rouge brun, elle n'est pas à employer. Les coupes suivantes sont meilleures. Elles doivent passer directement du rasoir sur le porte-objet; on enlève l'excès d'eau avec un morceau de papier à filtre, et on recouvre la coupe d'une goutte de glycérine.

Pas de couvre-objet : on examine la coupe à un grossissement faible: et à côté de nombreux précipités noirs qui ne peuvent être évités, on découvre alors les cellules et leurs prolongements. Toutes les cellules ne sont pas visibles: quelques-unes d'entre elles seulement sont imprégnées. Les coupes pratiquées plus avant dans l'intérieur delà pièce, ne présentent que de rares cellules imprégnées et n'en présentent souvent point du tout.

o° Les meilleures coupes passent du couvre-objet dans un bain d'eau distillée; elles y sont soigneusement lavées pendant une. deux ou cinq mi-

nutes. — 6° On les transporte ensuite dans le bain d'alcool absolu. — 7° Puis on les immerge pendant deux à cinq minutes dans de la créosote pure, (environ 3 centimètres cubes) puis pendant cinq à dix minutes dans 5 centimètres cubes de térébenthine. 9° On les place sur le porte-objet et on les recouvre d'une goutte de résine Dammar. Pas de lamelle couvre-objet. On les examine à un grossissement moyen (80 d.).

On conserve les coupes à l'abri de la lumière et dans un endroit sec. Lorsqu'elles sont sèches, on les examine à un grossissement plus fort (250- 300 d.)

Procédé mixte de Golgi. — Les pièces restent quatre ou cinq jours dans le liquide de Mùller, puis sont plongées dans le. mélange suivant :

Solution d'acide osmique à 1 p. 100 2 parties.

Solutiou de bichromate de potasse à 8 p. 100. . . 8 —

On les y laisse vingt-quatre à trente heures, et après les avoir séchées procédé mixte a,avec du papier buvard ou les avoir lavées à l'eau distillée, on les place pen- Golgldanl vingt-quatre ou quarante-huit heures, dans une solution de nitrate d'argent à 0,75' p. 100. On traite ensuite les coupes comme dans la méthode lente.

Procédé rapide de Golgi. — Ce procédé, qui a donné de si remarquables Procédé rapide de résultats, a été employé surtout par Ramon y Cajal, Kôlliker et van Gehuch- RamônT' caiaiPet ten. Il ne s'applique qu'à des pièces provenant d'embryons ou de sujets nouveau-nés, recueillies immédiatement après la mort. On procède de la manière suivante : on enlève avec soin le système nerveux central en entier, moelle et cerveau, la dure-mère comprise. On étend les pièces sur une planchette, puis on ouvre la dure-mère dans toute sa longueur. Le tissu nerveux étant mis à nu, on sectionne, à l'aide d'un rasoir très tranchant, des fragments de substance nerveuse de 3 à 4 millimètres d'épaisseur que l'on place, en les maintenant à l'abri delà lumière, dans le liquide suivant, ou mélange osmio-bichromique de Golgi.

Solution de bichromate de potasse à 3 p. 100. . . 4 parties. Solution d'acide osmique à 1 p. 100 1 partie.

Le séjour dans ce bain variera, suivant que l'on se propose d'étudier la névroglie, les cellules nerveuses, les fibres nerveuses, et sa durée croît suivant l'ordre que nous venons d'énumérer. Ramon y Cajal propose pour la moelle d'un embryon humain ou d'un mammifère nouveau-né, deux à trois jours pour la névroglie, trois à cinq jours pour les cellules nerveuses, cinq à sept jours pour les filets nerveux et leurs branches collatérales. On aura soin d'employer d'assez grandes quantités de liquide, 10 à 20 centimètres cubes par fragment.

On lave ensuite les pièces à l'eau distillée, et on les plonge dans la solution de nitrate d'argent à 75 p. 100. Cajal recommande d'ajouter une trace d'acide formique à la solution d'argent, une goutte pour 100 ce. delà

Kulliker.

solution (van Gehuchten). Cette addition d'un peu d'acide, favorise beaucoup la réduction (lajal). Comme pour le mélange osmio-bichromique, on emploiera ici une grande quantité de la solution d'argent. Les pièces restent au moins doux jours dans le bain d'argent, et en tout cas pas plus de quatre à cinq jours. Les coupes seront ensuite pratiquées en fixant le fragment, soit dans du sureau (Cajal), soit dans le collodion, après séjour pendant un quart d'heure dans l'alcool absolu et pendant le même temps dans une solution faible de collodion. Les coupes pratiquées subissent d'abord un examen préalable au microscope, afin devoir si l'imprégnation est bien réussie, puis sont placées dans de l'alcool absolu. Dans cette méthode, comme du reste dans toutes celles de Golgi, il ne faut pas chercher à obtenir des coupes minces, mais des coupes variant entre 0,05 et 0,1 millim. (von LenhosselO. On les déshydrate rapidement dans l'alcool, on les éclaircit avec de l'essence de girofle et du xylol, et on les monte dans la résine Dammar dissoute dans le xylol. 11 est nécessaire de faire sécher rapidement la résine à l'étuve, car on ne met pas de couvre-objet, pas plus dans le procédé rapide que dans les autres. Double et triple Pour obtenir de bonnes réductions par l'argent, R. y (lajal emploie la mon' /cajaK ' méthode de la double et même de la triple imprégnation et van Gehuchten a employé ce procédé pour les cellules nerveuses du sympathique. Après avoir fait une première imprégnation, comme dans le procédé rapide ordinaire que nous venons de décrire, les pièces sont lavées rapidement dans l'eau distillée, puis placées de nouveau et pendant trois jours dans le mélange osmio-bichromique. Sorties de ce liquide et lavées encore à l'eau distillée on les met pendant deux jours dans le bain d'argent. Pour obtenir une triple imprégnation, on recommence la même série de manipulations. Mdthode de Goigi Méthode de Golgi au sublimé (d'après Mercier). — Les pièces à traiter ne doivent pas avoir plus de 0,5 à 1,5 centimètres de côté. Elles plongent, jusqu'à durcissement obtenu, dans une solution de bichromate de potasse à 2 p. 100, ou dans le liquide de Mùller.

a) Renouveler fréquemment la solution durcissante — Employer de grandes quantités. — A la fin du durcissement, le titre de la solution peut être porté à 2,5 p. 100, à 3 ou 4 p. 100.

Les pièces y séjournent, les plus grosses de 2, 3 à 4 mois, les plus petites de 20 à 30 jours.

b) Elles passent ensuite directement, dans une solution à 0,50 p. 100 de sublimé corrosif dans de l'eau distillée.

On peut également essayer des solutions de sublimé à 0,25 p. 100 et de 1 p. 100.

La réaction qui s'opère dans le liquide mercurique est plus lente que dans la solution d'argent. La solution de sublimé doit être changée tous les jours et jusqu'à ce qu'elle ne se colore plus en jaune.

c) Après 4 à 5 jours de ce traitement, on peut essayer de faire des coupes des plus petites pièces qui sont alors suffisamment imprégnées. Mais il faut attendre 8 à 10 jours avant de couper les gros morceaux. L'imprégnation

thodes de Golgi.

se fait tantôt un peu plus vite, tantôt plus lentement, suivant la nature de la pièce; en général on peut dire qu'elle se fait d'autant mieux, que les pièces y sont soumises plus longtemps. A la fin de la réaction, les pièces présentent à peu près l'aspect d'un tissu cérébral frais mais lavé à l'eau. Au point de vue de leur conservation, elles peuvent rester indéfiniment dans la solution de sublimé.

d) Coupes. — Les coupes doivent être soigneusement lavées dans de l'eau distillée, quand il s'agit de les conserver. — Pour l'étude extemporanée et sans idée de conservation, on recouvre la coupe d'un peu de glycérine.

e) Bain d'alcool absolu, — créosote ou térébenthine comme agent éclaircissant. montage dans la résine Dammar sans couvre-objet.

Les cellules et leurs prolongements sont teints en noir, comme dans la méthode au sel d'argent. Cette dernière donne des résultats plus précis, aussi l'emploi du sublimé est-il aujourd'hui peu usité.

Les méthodes de Golgi ont rendu des services considérables en histo- importance des mélogie nerveuse. C'est grâce à elles et à la méthode d'Ehrlich, que ni sommes arrivés à connaître exactement les prolongements protoplasmiques et cylindre- axiles des cellules nerveuses, ainsi que leurs modes de terminaison. Les méthodes de Golgi présentent cependant les inconvénients suivants bien résumés par Mercier.

Sur une coupe traitée par ces méthodes, on constate qu'un petit nom- inconvénients de bre seulement des cellules nerveuses sont convenablement imprégnées, et que le nombre des cellules névrogliques imprégnées l'emporte sur celui des cellules nerveuses. Il existe dans les coupes de nombreux précipités qui obscurcissent les préparations et compliquent l'examen. Les cellules et leurs prolongements se ratatinent sous l'action du précipité du chromate d'argent. Les dépôts métalliques ne possédant pas l'élasticité des éléments organiques qu'ils recouvrent, ne peuvent s'adapter au mouvement de retrait que ceux-ci subissent pendant le durcissement, et il en résulte des brisures, des tassements en zig-zag. Aussi les prolongements des cellules ganglionnaires, colorées par la méthode de Golgi, ne sont-ils pas droits comme après l'emploi d'autres méthodes, mais forment une ligne brisée. Enfin, et c'est là un gros inconvénient, les chromâtes d'argent se résorbent facilement, leur coloration s'altère, et partant les coupes ne sont utilisables que pendant un temps limité.

En résumé, ainsi que nous avons été à même de le constater plus d'une fois, ces méthodes ne fournissent pas comme d'autres, ce qu'on est convenu d'appeler de « belles préparations » et sont, jusqu'à un certain point, assez capricieuses. Il n'en est pas moins vrai que ce sont les seules qui jusqu'ici, soient applicables à l'étude de la structure fine du système nerveux central, et les découvertes faites à l'aide de ces méthodes, ont produit une véritable révolution.

Pour parer aux inconvénients de ces méthodes, différentes modifications ont été proposées.

ces méthodes.

Modification des méthodes de Golpi.

Méthode de Flcchsïg.

Méthode de Zichc

Méthode de Flechsig. — Cette méthode a pour but de combiner la méthode de Golgi au sublimé, avec un procédé permettant de colorer la myéline. Les pièces sont d'abord traitées par le sublimé comme dans la méthode de Golgi. mais les coupes sont ensuite plongées dans un bain d'alcool à 90°, puis dans le liquide colorant suivant :

Extrait de carnpêche du Japon 1 gramme.

Alcool absolu 10 grammes.

Eau distillée 900 —

Solution saturée de sel de Glauber n —

Solution saturée d'acide tartrique '■> —

Elles doivent rester dans cette solution de trois à huit jours, dans une étuve à 35°.

Les coupes sont ensuite traitées par la méthode de Pal — permanganate de potasse, solution décolorante au sulfite de potasse et à l'acide oxalique — puis placées dans la solution suivante :

Alcool absolu 20cenlim. cubes.

Solution de chlorure d"or et de potassium à 1 p. 100. . 5 gouttes.

Le séjour dans cette solution, dure jusqu'à ce que le précipité de sublimé soit devenu noir foncé, et que les faisceaux nerveux aient pris une teinte bleuâtre.

On lave rapidement les coupes dans le mélange suivant :

Eau distillée 20 grammes.

Solution de cyanure de potassium à b p. 100 1 goutte.

On les traite par l'alcool absolu, l'huile de lavande et on monte dans le baume de Canada. Avec cette méthode les fibres nerveuses apparaissent colorées en rouge, tandis que les cellules ganglionnaires et leurs prolongements sont noirs.

MétJiode de Ziehen. — Des fragments de svstème nerveux central, recueillis aussi frais que possible, sont durcis dans le mélange suivant :

Solution de chlorure d'or à 1 p. 100 ) ,. . ,

e i i a vi ■ - • j mn Parties égales.

Solution de sublime a 1 p. 100 ) c

Après un séjour de quelques semaines, à trois ou cinq mois dans ce liquide — le séjour prolongé est le meilleur. — les pièces ont pris une coloration rouge-brun, et sont assez dures pour être coupées, sans qu'il soit nécessaire d'avoir recours à un enrobement spécial.

Les coupes une fois pratiquées sont plongées quelques instants dans de l'alcool, où elles prennent une coloration noirâtre. On procède ensuite à leur différenciation dans la solution de Lugol

Iode métallique 20 grammes.

Iodure de potassium 40 —

Eau distillée 1000 —

MÉTHODES USITEES DANS L'ETUDE DES CENTRES NERVEUX. o3

étendue de quatre parties d'eau. Le séjour des coupes dans la solution de Lugol varie suivant leur épaisseur. On les lave ensuite avec soin dans l'alcool absolu, on les éclaircit à l'essence de girolle et on les monte dans le baume de Canada. Eviter dans les différentes manipulations, de saisir les coupes avec un instrument, métallique.

Avec la méthode de Ziehen, les fibres à myéline et sans myéline, les cellules nerveuses avec leurs prolongements cylindre-axiles et protoplasmiques, sont colorées en bleu-gris. Les noyaux et les nucléoles des cellules nerveuses sont également colorés et différenciés. Cette méthode n'est pas absolument constante.

Méthode de Greppin. — Cette méthode s'applique aux coupes déjà Môthodc do Greppin. colorées par la méthode de Golgi au nitrate d'argent. Les coupes ainsi traitées, sont placées dans une solution d'acide bromhydrique à 2 p. 100 jusqu'à ce qu'elles aient pris une coloration bleuâtre, puis lavées à l'eau distillée et à l'alcool. On les place ensuite dans une cupule contenant de l'essence de girofle, et on expose le tout, pendant quelques minutes, à la lumière solaire, aussi intense que possible. Après déshydratation et éclaircissement, on monte la préparation dans le baume de Canada, en recouvrant d'un couvre-objet. Pour obtenir une double coloration, on prend les coupes au sortir de l'essence de girolle, on les place pendant six à douze heures dans une solution d'acide chromique à 1/2 p. 100, et on les colore à l'hématoxyline selon les méthodes de Weigert ou de Pal. R. y Cajal reproche au procédé de Greppin de ne pas respecter les fines ramifications nerveuses.

7. Examen microscopique des coupes. — L'étude des coupes microscopiques Examen mierosco-

, -, , . . . . „ „ . , ., , .. , . pique des coupes.

sériées doit être pratiquée, comme on le sait, a 1 aide d un iaible grossissement. On peut se servir pour cette étude de la loupe à dissection de Nachet ou du microscope. Comme on doit en général — surtout lorsqu'il s'agit du cerveau — étudier des coupes présentant une large surface, il faut avoir à sa disposition un instrument qui donnant un grand champ de vision, soit muni en outre d'une platine suffisamment large, pour que l'on puisse examiner dans toute son étendue, une coupe entière d'hémisphère.

Le microscope que M. Nachet a construit d'après nos indications, remplit complètement ces conditions. Cet instrument (fig. 8) est muni d'une platine de grande dimension, en verre, placée sur un cadre (G) pouvant, au moyen d'une crémaillère, se déplacer d'avant en arrière d'une distance de 8 centimètres. Le support du corps (D) portant la partie optique, peut pivoter sur un axe situé dans la colonne C, au moyen d'une vis tangente V et donner une amplitude de marche de 14 centimètres. On peut donc examiner méthodiquement toutes les parties de la préparation et sans toucher à cette dernière, à l'aide d'un déplacement longitudinal de la platine et du déplacement transversal du tube du microscope. L'éclairage est obtenu à l'aide d'un miroir plan pour les grandes préparations, et d'un miroir concave pour les petites. Dans ce cas, la platine de verre est rem-

placée par une plaque d'ébonite, avec ouverture centrale et diaphragme

iris.

Ce microscope est muni d'oculaires et d'objectifs à grand angle ^d'ouverture, permettant l'examen de grandes surfaces. C'est ainsi qu'avec l'ob-

Fig. 8. — Microscope de Nachet à platine mobile et axe optique tournant, pour l'étude des grandes

coupes microscopiques du cerveau.

jectif n° 1, donnant un grossissement de cinq diamètres, on embrasse une surface de 50 millimètres. Avec l'objectif n° 2 et un grossissement de douze diamètres, la surface embrassée est de 18 millimètres. Avec cet instrument on peut examiner aussi les préparations avec de forts grossissements, sans avoir besoin de les recouvrir avec des lamelles minces, car les objectifs de Nachet ont un foyer plus long que ceux des autres constructeurs.

macroscopiques par le procédé du calque.

MÉTHODES USITÉES DANS L'ÉTUDE DES CENTRES NERVEUX, oo

8. Reproduction des coupes. — Dessin. — Appareils de projection. — Avantages du des- Jusqu'ici, malgré des essais parfois très heureux, la photographie n'a pas pm0^ur la photoeva" encore remplacé le dessin, pour la reproduction des coupes du système nerveux. Pour les coupes macroscopiques, les résultats si remarquables obtenus par Luys, et qui n'ont pas encore été dépassés, ne nous paraissent pas cependant égaler ceux que l'on peut obtenir d'un dessinateur habile et, pour les coupes microscopiques, il est certain que jusqu'ici, surtout lorsqu'il s'agit de reproduire de larges surfaces, l'avantage est encore resté au • dessin.

Les reproches que l'on adresse au dessin, comme agent de reproduction Dessin par io caide coupes, en particulier celui de n'avoir pas la précision mathémathique ^on.etpai d'une photographie, peuvent être évités en usant du procédé du calque ou en dessinant la préparation au moyen d'un appareil à projection. Voici la manière dont nous avons procédé, pour dessiner les coupes macroscopiques et microscopiques reproduites dans cet ouvrage.

Coupes macroscopiques. — Ces coupes ont d'abord été calquées par l'un Dessin, des coupes de nous, et daus tous leurs détails sur verre dépoli. Puis, ce premier dessin, purement linéaire, était calqué de nouveau et sur papier par le dessinateur qui, ayant la préparation sous les yeux, donnait ensuite la note générale des valeurs et des tons.

Coupes microscopiques. — La chambre claire est l'instrument générale- Emploi do la

, j • i ,. ■• • ■ . , chambre claire do

ment employé pour dessiner les préparations microscopiques, et on se sert Maiassez. de préférence de l'excellente chambre claire de Malassez, qui fournit des images sans déformation aucune. Nous avons employé cet instrument pour dessiner nos coupes de la moelle épinière. Mais l'emploi de la chambre claire n'est possible, qu'avec des coupes présentant de petites dimensions et il est inapplicable dès que ces coupes comprennent une certaine surface. Aussi, après avoir étudié différents procédés, nous sommes-nous arrêtés à la reproduction des coupes au moyen d'un appareil à projection.

Cette méthode a déjà été employée dans ce but, et Edinger a construit Dessin au moyen un appareil, qui rend des services pour reproduire les coupes de petites dimensions — moelle de l'adulte, bulbe de fœtus — mais qui ne peut servir pour des coupes plus grandes. L'appareil que nous avons fait cons- Appareil dEdinger truire, permet de projeter des coupes microscopiques d'un hémisphère entier. Deux conditions sont nécessaires pour obtenir de bons résultats avec cet appareil : Il faut tout d'abord que les coupes soient minces, afin Appareil employad'être facilement traversées par la lumière, et en outre qu'elles soient colorées par les méthodes de Weigerl ou de Pal, méthodes qui, en différenciant fortement les faisceaux de fibres à myéline, fournissent une image autrement nette, que celle que l'on obtient par la méthode au carmin.

Cet appareil, construit sur le principe de la lanterne magique, se compose d'une lanterne et d'un objectif à deux lentilles et à grande ouverture, et dont la mise au point se règle au moyen d'une vis à crémaillère (V). L'éclairage qui doit-être très intense — il équivaut dans notre appareil à soixante bougies — est obtenu au moyen d'une lampe à pétrole à cinq

d'appareils de projection.

pour les petites coupes.

par nous.

mèches et, comme cet éclairage nécessite un puissant tirage, la lanterne doit être munie d'une très longue cheminée (fig. 9).

La préparation que l'on veut projeter est placée comme dans une lanterne magique ordinaire et, afin d'éviter qu'elle ne s'altère sous l'influence de la chaleur, on la fixe sur une cuve en verre (C), contenant une solution d'alun à 1/20°.

L'agrandissement de l'image, à l'aide de cetappareil, est nécessairement

Fig. 9. — Appareil à projection employé pour dessiner nos préparations.

variable suivant que l'on veut en faire usage pour projeter une préparation dans une salle de cours, — et alors cet agrandissement peut être considérable — , ou au contraire, et c'est de cette manière que nous nous en sommes servis, l'employer pour le dessin. Dans ce cas, l'agrandissement est obtenu par un long tube à tirage (T) sur lequel est fixé l'objectif, et la mise au point s'obtient à l'aide de la vis à crémaillère (V). L'agrandissement que nous avons employé a varié suivant les coupes de 1/2 à 10 diamètres. La projection de l'image sur la table s'obtient à l'aide d'un miroir plan (M), fixé à la lentille frontale de l'objectif et incliné à 45°. Avec une bonne mise au point et un bon éclairage, on obtient avec cet appareil des images extrême-

ment nettes et qu'il est très facile de dessiner à la plume ou au crayon, dans leurs moindres détails. On obtient ainsi des contours très justes, et une mise en place absolument exacte des faisceaux nerveux ainsi que des noyaux gris. Toutefois, comme avec cet appareil on obtient un agrandissement et non un grossissement de la préparation, il faut achever le dessin de celle-ci à l'aide du microscope.

Tel est le procédé, que nous avons employé pour dessiner les préparations figurées dans cet ouvrage — celles de la moelle exceptées — et, pour continuer à nous servir de méthodes ne donnant pas de prise à l'interprétation personnelle, nous avons fait reproduire ces dessins à l'aide de la photogravure.

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