FERMENTATIONS NITREUSE ET NITRIQUE

générales, s'exercent sur les sels ammoniacaux et sont particulièrement actives dans la terre arable, où l’ammoniaque provient, comme il a été dit plus haut (p. 1258), d’une première transformation des matières organiques azotées,

Sous l’action successive du Microcoque nitreux (Bactérie nitreuse) (fig. 1689) et de la Bactérie nitrique (fig. 1691), les composés ammoniacaux sont oxydés et convertis en définitive en nitrates. Le premier de ces organismes transforme simplement les sels ammoniacaux en nitrites par une première oxydation, dite ritrosation : c'est le ferment nitreux ; le second transforme les nitrites en nitrates, aliments azotés par excellence des plantes supérieures {nitratation) : c'est le ferment nitrique. Les nitrates correspondent normalement à la métamorphose dernière des matières organiques terrestres : toutefois, 1l peut survenir encore une dénitrification (p. 1272).

C'est au travail incessant de ce groupe particulier de microorganismes, les Nifrobactéries, partout répandues dans le sol, que les plantes vertes supérieures doivent de trouver dans la terre les nitrates, indispensables à leur végétation.

a) Preuve du phénomène. — Pour mettre ces fermentations en évidence, on peut faire usage de la liqueur nutritive suivante, en vérifiant préalablement la pureté des divers produits employés :

Sulfate d'’ammonium (matière fermentescible)..…., À gr. ;

Phosphate de potassium..., 1 gr. ;

Eau ordinaire..…, 1 litre.

On verse environ 100 centimètres cubes de cette liqueur dans une série de matras de verre à fond plat, en délayant en outre dans chacun d'eux environ 0 gr.,5 ou 1 gr. de carbonate de magnésium pur ; on ferme ensuite avec un tampon d’ouate ou d'amiante et on stérilise. Pour l’ensemencement, on délaye simplement un peu de terre arable dans de l’eau distillée, et l’on dépose dans chaque matras quelques gouttes du mélange ainsi obtenu.

L'accès de l'air doit être largement assuré ; car les ferments nitreux et nitrique sont essentiellement aérobies. On peut ne couvrir les matras ensemencés que d’un capuchon de papier.

Or, dès le quatrième ou le cinquième jour, à la température ordinaire, de l'acide nitrique, sous forme de nitrate de magnésium, se constitue dans la liqueur.

Quant à l'acide nitreux, il est souvent déjà reconnaissable, alors qu'il n’y a pas encore trace d'acide nitrique.

1268 FERMENTATIONS BACTÉRIENNES

Réactifs des nitrates el nitrites. — Pour déceler les nitrates, il suffit de traiter quelques gouttes de la liqueur, préalablement concentrées par évaporation, par la solution sulfurique de diphénylamine (p. 158) : ce réactif se colore en bleu, en présence de traces d’un nitrate.

Toutefois, comme la liqueur renferme aussi du nitrite de magnésium, il convient d'éliminer préalablement lacide nitreux, en chauffant la liqueur avec du chlorhydrate d'ammonium en excès et de l’urée.

Pour déceler les nitrites, on ajoute à une petite quantité de liqueur trois gouttes environ d’une solution saturée d’acide sulfanilique et une goutte d'acide chlorhydrique ou acétique au dixième ; puis trois gouttes d’une solution saturée de naphtylamine. Si la liqueur renferme un nitrite, il se produit une coloration rouge.

b) Observation des Nitrobactéries. — A la longue, au bout de quinze jours environ, l'acide nitreux et l’ammoniaque ont disparu entièrement, et la liqueur ne renferme plus, comme produit azoté, que de l'acide nitrique, sous forme de nitrates. Le dépôt de carbonate de magnésium se montre alors couvert d'une sorte de voile fin, gélatineux ou floconneux, dans lequel végèlent précisément les deux ferments oxydants qu'il va s'agir maintenant d'isoler.

Pour l'observation microscopique de ces organismes, on étend une petite parcelle du dépôt sur une lame et on laisse sécher ; on y verse ensuite un peu de vert malachite ; puis, au bout d’une demi-minute, on lave, et on traite pendant le même temps par le violet de Gentiane ; enfin on monte au baume de Canada. On peut employer aussi la fuchsine.

Des matras témoins, n'ayant reçu que la solution nutritive stérilisée et abandonnés à l’air bibre, n’offrent, au bout du même temps, que les traces de nitrates qu'apportent toujours avec elles les poussières atmosphériques et qui n'augmentent pas d'une façon sensible pendant la durée de l'expérience. Il résulte de là que les ferments nitreux et nitrique n'existent pas, comme tant d’autres, dans l'air atmosphérique, tout au moins à l’état actif, et, comme le vent soulève avec la plus grande facilité la terre arable desséchée et en dissémine la poussière au loin, il y a lieu d'admettre que c’est à leur srande sensibilité à la dessiccation que ces organismes doivent de ne pas pouvoir subsister dans l'air.

c) Aliment des Nitrobactéries. — Les Nitrobactéries ne se développent pas sur la gélatine nutritive : l'abondance des matières organiques est, d'une manière générale, peu favorable à la mitrification.

Un caractère tout à fait exceptionnel, unique chez les végé-

OBSERVATION DES NITROBACTÉRIES 1269,

taux sans chlorophylle, est que ces organismes nitrifiants peuvent vivre et se multiplier dans des milieux purement minéraux, exempts même de traces de carbone organique et ne renfermant, par suite, comme aliment carboné, que de l’anhydride carbonique, sous forme de carbonate de calcium ou de magnésium. Par là, les Nitrobactéries se rapprochent des plantes vertes, qui, elles aussi, ne tirent leur aliment que de principes minéraux ; mais, tandis que les plantes vertes ne peuvent assimiler l’anhydride carbonique qu'à la faveur de la radiation lumineuse, par l'intermédiaire de la chlorophylle, les Nitrobactéries se lincorporent directement, sans le secours de ce pigment, et à l'obscurité comme à la lumière ; il suflit seulement que la température soit convenable. Ces microorganismes effectuent, par suite, plus directement encore la synthèse de la matière vivante que les végétaux verts.

Milieux de culture. — On cultive les Nitrobactéries, soit en solution nutritive minérale, soit dans cette même solution, gélatinisée par la silice, toujours à l’air libre, les récipients étant simplement fermés avec un tampon d'amiante : en l’absence d'oxygène atmosphérique, il ne se produit aucune nitrification. En outre, le milieu doit être alcalin, pour assurer la neutralisation des acides, issus de l'oxydation.

La solution nutritive des deux ferments ne diffère que par la nature de la matière fermentescible. Elle renferme :

Matière fermentescible :

a) Nitrite de potassium, pour le ferment nitrique. Osr,

b) Sulfate d'ammonium, pour le ferment nitreux . 0 ,# Bulatetdemmagnésinmni sl +:1.45%00u @ cest ROM 07,00 Phosphate de potassium . CA MTbOnALeNle SOUIUM. 2. «+ 21 2 «let 2 0 Lea NOT 0 Ghlonuretde calcium eu. DE EN NN PER NE RELTACES raie de calcium 77 [2 ONE LE REX GES PI EEN RR. MS MiE bCL Rae, en AU LUN SUR

En employant des sels strictement purs et des vases soigneusement lavés aux acides, puis à l’eau distillée, on réalise un milieu entièrement minéral. Or, les Nitrobactéries y végelent activement, et si le carbonate de calcium y à été déposé en fragments, cubiques par exemple, ces fragments se couvrent à la longue de colonies et finissent par disparaitre, sous l'attaque des acides engendrés; ils sont alors remplacés par des amas bactériens de même forme. Tandis que l’anhydride carbonique du calcaire a été assimilé par les Bactéries, la chaux a servi à neutraliser l'acide nitreux et l'acide nitrique, engendrés au cours de l'oxydation.

1270 FERMENTATIONS BACTÉRIENNES

d) Cultures pures : isolement des ferments nitreux etritrique. — L'aliment fermentescible du ferment nitreux étant lammoniaque, et celui du ferment nitrique, l'acide nitreux ; d'autre part, l'acide nitreux étant nuisible au ferment nitreux, et l'ammoniaque au ferment nitrique, c’est en partant de solutions nutritives, qui ne renferment que l’un ou l’autre de ces composés azotés, que l’on peut arriver à isoler les deux organismes oxydants, lesquels coexistent dans la terre arable, ainsi que dans les premières cultures qui en proviennent.

Ferment nitreux. — Pour obtenir, par exemple, le ferment nitreux, on dépose, comme il a été dit précédemment, dans une solution nutritive qui ne renferme, comme aliment azoté, que le sulfate d’ammonium,

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5 8 8 Fig. 1689. — Microcoque nitreux (ferment nitreux) : parcelle, colorée à la

fuchsine, du voile formé au fond d'une culture en solution nutritive minérale, et en provenance de Zurich (gr. : 1000) (Winogradsky).

Fig. 1690. — Microcoque nitreux des terres de Gennevilliers, près Paris, en provenance d'une culture sur silice gélatineuse (gr. : 1000) (Winogradsky). Fig. 1691. — Bactérie nitrique, en provenance d'une terre de Quito, cultivée en

solution de nitrite : parcelle de la membrane qui couvre le fond du matras de culture, préalablement colorée au vert malachite ou à la fuchsine (gr. : 800) (Winogradsky).

une parcelle du dépôt bactérien, puisé dans une culture antérieure, où la production des nitrites a été reconnue très active. Il importe de veiller à ce que le sel ammoniacal ne s’épuise pas; car on établirait par là même une condition favorable au ferment nitrique, qu'il s'agit précisément d'étouffer. Cette nouvelle culture est à son tour ensemencée dans une solution nutritive fraiche, etc., ce qui augmente petit à petit la production des nitrites, au détriment de celle des nitrates.

Après une série de cultures pratiquées de la sorte, on obtient, sur le dépôt de carbonate de calcium, une colonie dont les caractères extérieurs restent constants: au microscope, on n’y observe, après coloralion, qu’une seule forme bactérienne (fig. 1689 et 1690), à cellules ovoïdes, tantôt isolées, tantôt en voie de division, et rarement associées en chaïinettes. La longueur de ces cellules est d'environ 1 à 2 p; leur largeur, de 1 p. C’est là le Microcoque nitreux (Bactérie nitreuse).

Et en effet, transporté dans de nouveaux liquides ammoniacaux, cet organisme y donne naissance exclusivement à des nitrites, qui s'accu-

OBSERVATION DES NITROBACTÉRIES 1271

mulent dans la liqueur. C’est donc bien une espèce différente qui accomplit l'oxydation dernière, d'où naît l'acide nitrique.

Ferment nitrique. — Pour isoler maintenant le ferment nitrique, opération plus facile que la précédente, on ensemence des solutions nutritives, qui ne renferment, comme aliment azoté, que du nitrite de potassium, en partant d’une des cultures premières, dans laquelle l'oxydation des nitriles est très active : les cultures successives deviennent alors le siège d’une nitratation de plus en plus prépondérante, et la colonie qui se constitue au fond renferme une Bactérie nouvelle. Le ferment nitreux ne s’y maintient pas, faute d'ammoniaque.

En effet, en transportant une trace du dépôt de la troisième ou quatrième culture dans le milieu ammoniacal, propre à la Bactérie nitreuse, il ne s’y produit rien, pas plus de nitrates que de nitrites. La Bactérie nouvelle ainsi isolée n’a donc aucune action sur l’ammoniaque ; mais elle oxyde les nitrites et les amène à la forme ultime de nitrates. C'est là la Bactérie nitrique (fig. 1691) ; elle est plus petite que l'espèce précédente (— à 1 u de longueur), mais proportionnellement plus allongée.

f) Nitrification dans les cultures et dans le sol. — L'oxydation exercée par le ferment nitreux en milieu ammoniacal est beaucoup plus énergique que celle exercée par le ferment nitrique en milieu nitreux. Il faut environ trois fois plus d'oxygène pour transformer un poids donné d'azote ammoniacal en azote nitreux que pour convertir ce même poids d'azote, pris à l’état nitreux, en azote nitrique. C'est ce qui résulte des équations suivantes, dans lesquelles les acides sont supposés anhydres :

2 AzH3 + O$ — A7°05 + 3 H?0 (nitrosation).

Az20$ + O0? — Az?0° (nitratation).

Ce sont ces oxydations qui fournissent aux Nitrobactéries l'énergie nécessaire à l’entretien de leur vie.

On comprend, d’après cela, pourquoi, dans les cultures en milieu liquide, où les colonies se forment toujours au fond, sur le carbonate de calcium, la Bactérie nitreuse prend si souvent l'avance : étant plus avide d'oxygène, elle étouffe plus ou moins complètement le ferment nitrique. De là aussi la présence, dans ces liqueurs, de nitrites libres.

Dans le sol arable, au contraire, on n’observe presque jamais le stade nitreux : la production des nitrites n'y est que transitoire, et ces sels, aussitôt engendrés, sont au fur et à mesure convertis en nitrates par la Bactérie nitrique. Cette différence, par rapport à ce que l’on constate dans les solutons nutrilives, tient à la porosité du sol, qui assure une

1972 FERMENTATIONS BACTÉRIENNES

aération suffisante au développement simultané des deux ferments: la nitratation est en effet surtout active dans les terres meubles. Mais 1l suffit de stériliser la terre arable et de lensemencer ensuite de ferment nitreux pur, pour n’obtenir que des nilriles, sans augmentation de la teneur en nitrates.

L'optimum de températuré pour la nitratation est de 37°; le minimum, de 5°, et le maximum, de 55°.

Gisements naturels de nitrates. — La nitratation ne s'effectue pas seulement dans la terre arable. C’est aussi cette fermentation qui donne naissance aux efflorescences blanches de salpêtre (nitrate de potassium), qui couvrent les murs humides (écuries, caves, ponts), ou même la surface du sol, comme dans les nitrières naturelles d'Egypte, de Ceylan, etc.

Les gisements naturels les plus remarquables des nitrates d’origine bactérienne sont les gisements anciens du Pérou et du Chili : le nitrate de sodium y est associé à de l'argile, à du chlorure de sodium, ainsi qu'à de l'iodate et du bromate, ce qui indique l'intervention des eaux marines dans la formation de ces dépôts géologiques.

Or, l’eau de mer renferme l’iode et le brome à l’état d'iodures et de bromures ; il est donc vraisemblable que ces deux genres de sels ont subi l’oxydation, en même temps que l'azote ammoniacal, et se sont trouvés ainsi transformés en iodates et bromates. C'est ce que corrobore l'expérience directe : si, en effet, l’on additionne de bromure ou d’iodure de potassium une culture pure de ferment nitrique en activité, ces sels se convertissent respectivement en bromate et en iodate.

Toutefois, on pense que tous ces sels du Pérou ne se sont pas constitués sur place dans leurs gisements actuels, mais qu'ils y ont été amenés en dissolution, puis seulement déposés dans de vastes bassins de réception, lagunes ou estuaires, à la suite de l’évaporation de l’eau. C’est qu’en effet on n’y rencontre pas de phosphate de calcium, et ce dernier sel se constitue toujours au cours de la décomposition des matières organiques phosphorées naturelles (albuminoïdes), qui alimentent les fermentations ammoniacale, nitreuse et nitrique. Le phosphate de calcium, insoluble dans l’eau, serait donc resté seul au lieu d’origine, tandis. que les nitrates, les iodates, etc., auraient été transportés en dissolution dans l’eau, puis déposés après évaporation.

Les nitrates du Chili et du Pérou sont très employés en agriculture.

8° Dénitrification. — Plusieurs espèces de Bactériacées sont douées du pouvoir de réduire les nitrates et de donner lieu à un dégagement d'azote libre ou d'oxyde azoleux.

Ces Bactéries dénitrifiantes se rencontrent notamment dans les excréments des animaux et dans le fumier; elles interviennent aussi dans la putréfaction des tissus animaux ou végétaux (p. 1260). Lorsqu’elles viennent à se développer dans la terre arable, elles l'appauvrissent en azote, au préjudice des plantes de culture.