Avec les antiseptiques, même résultat

Le 6 août, on met à 35 degrés des flacons pleins d'eau d'égout nitratée et stérilisée , avec les antiseptiques suivants :

flacon a 100"*' d*acide salicyllque par litre.

«— ^ — de saiicylate de sonde —

— c — d'acide phéniqae —

— d — de sulfate de cuivre —

— e — quelques gouttes de chloroforme

avec lesquelles Teau d'égout ^

est agitée.

Tous ces liquides reçoivent en outre une forte dose de semence prise dans une fermentation achevée.

La proportion de nitrate détruit a été successivement :

8 *oAt. 10 août. S6 aoAt.

Dans le flacon a 0 p. 100 37 p. 100 74 p. 100

— d néant. néant. néant.

— e néant. néant. néant.

Le nilrate de potasse est donc resté intact pendant vingt jours avec deux des antiseptiques employés, le sulfate de cuivre et le chloroforme ; les liquides correspondants sont restés parfaitement limpides.

Quant à l'acide salicylique, le salicylate de soude et l'acide phénique, ils n'ont fait que ralentir la marche de la dénitrification. Les liquides ont donné du trouble, de la mousse, et se sont peuplés de microbes. Rien plus, l'acide saHcylique a disparu dans n, et ne reste qu'à l'état de traces dans h; Todeur d*acide phénique est complètement insensible dans c. Nous trouverons plus loin Texplication de ce fait, qui se produit même avec des doses plus élevées que dans l'expérience actuelle.

Il résulte de là qu'il y a corrélation entre la destruction des nitrates et le développement des infiniment petits.

18. Purification des microbes dénitrifinnis, — Avant d'aller plus loin dans cette étude, il importait de préparer des microbes dénitrifianls à l'état de pureté. Nous avons employé pour cela les cultures dans des liquides stérilisés, en faisant varier successivement la composition de ces liquides, leur épaisseur, leur température, et en essayant sur la semence l'action de la chaleur, de la dilution, de Tâge, de l'acide carbonique, du vide, etc. \

19. Pour les cultures en profondeur, nous avons adopté le tube de la figure \ qui n'est, comme on le voit, qu'une modification du matras Pasteur. Il a l'avantage de n'exiger que peu de liquide et peu de place. Le réservoir A n'a en effet qu'un cenliroètre à un cenli-

1. Voir L. Grandeau, Traité d'analyse des matières agricoles, 2* édition, p. 586.

mètre et demi de diamètre cxlérieur, pour une capacilc de 5 à 8 c<>ntimètres cubes.

Dans quelques cas, nous avons ulîUsé avec prolll les disposilifs des ûgui'os S et 3 ; ils ont tous le même but : séparer en un très petit oombre d'opérations, même en une seule, le microbe qui convient le mieux à un li((uidc donné.

Fiçi.i.

Les tubes A sont ceux de la figure 1, à l'intérieur desquels on introduit soit un tube C (iig. S) plusieurs fois replié sur lui-même dans le sens vertical, soit un petit serpentin S (fig. 3), dont le tube n'atteint pas un millimètre de diamètre.

Ces appareils ayant été stérilisés et remplis d'un bouillon de culture convenable, on dépose, à l'aide d'un tube effilé, une goutte de semence impure dans l'ouverture a. Le microbe qui s'accommode le mieux du liquide nutritif, ou biun celui qui se trouve te plus anaérobie, se développe de préférence, et parcourt toute la longueur du

tube avant de gagner rorifice o et do tomber dans le liquide extérieur. Il est rare que plusieurs êtres puissent ainsi cheminer parallèlement dans un tube capillaire, sur une longueur de plusieurs décimètres; mais, comme ils peuvent se suivre à petite distance, il faut avoir soin de faire une nouvelle culture avec une goutte du liquide extérieur, dès que celui-ci est ensemencé.

Il ne faut pas attendre pour cela que le trouble s'y manifeste ; il est préférable d'y faire des prises très fréquentes, tous les quarts d'heure par exemple , à partir du moment où le trouble du liquide contenu dans le tube capillaire s'est propagé jusque dans le voisinage de l'extrémité o.

En recommençant l'opération deux ou trois fois, surtout avec des liquides variés, on arrive rapidement à la purification de l'espèce cherchée.

Si, dans les conditions de l'expérience, il y a production de gaz, les appareils ne peuvent convenir; on change alors le liquide de culture.

20. Le dispositif de la figure 4 est destiné à rendre les mêmes services ; il est d'une construction plus diflicile, mais d'une manipulation plus commode et plus sûre. Le serpentin S, au lieu d'être libre, est soudé par son orifice supérieur, en /, à un étranglement du tube A. On a soudé latéralement un réservoir à boule C, fermé par un bouchon conique à recouvrement B'. En déposant la semence impure en a, on n'a pas à craindre de la répandre dans le liquide extérieur; puis, quand le microbe purifié est sorti du serpentin, on fait aisément les prises de la nouvelle semence en a\

21. A l'aide des divers procédés ou appareils que nous venons d'indiquer, nous avons obtenu plusieurs variétés de microbes dénitrifiants, dont les germes se trouvaient primitivement soit dans l'eau d'égout, soit dans la terre végétale, soit dans les poussières de l'air. Il faut remarquer que la purification de tels êtres présente une facilité rela-

/iy.4.

live, grâce à la conipositioa particulière des liquides de culture , (l(Mit le nitrate s'oppose au développement d'un grand nombre d'espèces.

Nous en avons spécialement étudié deux que nous allons maintenmi décrire sous le nom de Baderium demirificans , Comme ces or- ^smes ont de grandes ressemblances, nous les distinguerons seulement l'un de l'autre par les lettres a et p. C'est avec le premier, qui est le plus actif, que nous avons fait la plupart de nos expériences. 22. BacteriUm denitrifieam a (fig. 5). — Ce microbe est une bactérie de 0,4 à 0,6 ji. de largeur etde 9 à 4 ji.de longueur; ses dimen- 5JO0S sont en général un peu plus grandes dans les liquides artificiels <j|ue dans les bouillons de viande.

Sa réfringence est faible et ses contours ne sont nettement accusés que dans les préparations colorées. Il est plus facile à observer dans les liquides artificiels que dans les bouillons.

Ouand on examine au microscope une culture récente dans un milieu nitrate, on voit un assez grand nombre de bactéries immobiles, tandis que d'autres sont animées de mouvements parfois très vifs. Dans les préparations faites avec des liquides dépourvus de nitrates, peu d'instants après la mise en place du couvre-objet, les microbes mobiles sont relativement plus nombreux et leurs mouvements plus rapides; au bout de quelques minutes, presque tous cessent de se mouvoir au centre de la préparation ; mais le mouvement continue vers les bords de la lamelle. Le contraste est bien plus frappant , si on laisse une bulle d'air sous le couvre-objet ; autour de cette bulle les microbes s'agitent avec une extrême vivacité; la rapidité de leur allure est si grande qu'il est presque impossible de les- suivre dans leurs déplacements ; tantôt ils décrivent des courbes irrégulières, tantôt ils vont ^n ligne droite, s'arrètant parfois brusquement pour repartir en sens opposé; souvent ils sont animés d'un mouvement d'oscillation rapide ou de vibration. Après un certain temps, les bactéries se rapprochent de plus en plus des bords de la bulle, si bien qu'elles ne peuvent alors que s'agiter sur place, jusqu'au moment où elles sont assez serrées les unes contre les autres pour être complètement immobilisées.

L'espace qui entoure immédiatement cet amas de microbes est à

peu près complètement dépourvu d'organismes; un peu au delà, on trouve, disséminés et immobiles, ceux qui étaient hors de la zone de diffusion de Toxygène.

On peut dire que l'observateur assiste à la formation, autour de la bulle d'air, d'une véritable zooglœa, semblable à celle qui se produit, comme on le verra, à la surface des bouillons de culture exempts de nitrates, et exposés au contact de l'air extérieur.

Le B. denitvificaiis se multiplie par sissiparité dans les premiers jours de son développement, quel que soit le liquide de culture; plus tard, on voit apparaître de une à trois spores dans chacjue bâtonnet; quelquefois, leur nombre atteint cinq ou six, dans des filaments plus longs, mais formés vraisemblablement de deux bactéries soudées l'une à l'autre et dont la ligne de séparation est difficile à saisir. Cette observation ne se fait bien que dans une préparation colorée, car dans l'état normal, la réfringence de la spore diffère à peine de celle du bâtonnet lui-même.

La formation de spores est précédée d'une accumulation de matière protoplasmique, sous forme de corps allongés, qui occupent une longueur variable dans chaque bâtonnet, et qui se résolvent ultérieurement en corpuscules sphériques. Leur présence explique comment les germes de la bactérie conservent leur vitalité dans certains miheux pendant des années entières.

23. Bacterium denitrificam p. — 11 diffère peu au microscope du Bacienum dcnUrifican^i ol\ il est seulement un peu plus réfringent et un peu plus large; sa largeur est de 0,5 à 0,7 pi. Il est assez difficile de les distinguer l'un de l'autre, autrement que par la rapidité de leurdéveloppemenl et par les produits de leur action sur les nitrates, quand on les cultive comparativement dans les mêmes milieux. Nous indiquerons chemin faisant ces différences.

24. Coloration des microbes. — On peut colorer les bactéries dénitrifiantcs avec diverses matières colorantes; celles que nous avons spécialement essayées sont :

Le bleu de méthylène;

Le brun de phénylène (vésuvinei^

Le violet de luélhyle B;

Le violet de gentiane.

Afin Science A^

Fip I- BACTHHIU.M DENITRIFKANS .-,.

Fig2-BAU1LLUS A.HYI.OBACTKK U.-=.

cadrés '.:."iiî Dr.D^oc.'.'Vipni'; de '/.St^liuslpr

BACTKBIU.M DliMTlMFKANS ..t..

rie2- BACll.LUS A-MYI-OliACIKH

Le bleu de méthylène et le brun de phénylcnc sont absorbés lentement et ne donnent que des colorations peu intenses.

Les violets de métliyle et de gentiane donnent au contraire d'excellents résultats, mais le second est d'un emploi un peu plus avantageux que le premier.

Si la préparation colorée ne doit pas être conservée, il suffit de mélanger une goutte de liquide de culture avec une très petite quantité de solution de violet de gentiane à 0.5 p. 100. Cela convient très bien pour l'observation des spores.

Si, au contraire, la préparation est destinée à être conservée, on étale à l'aide d'un fil de platine une très petite goutte de licpiide contenant les bactéries sur une lamelle couvre-objet ou nueux sur une lame porle-objet, préalablement débarrassées des plus infimes traces de matières grasses par un lavage à Télhor alcoolisé. 11 convient de les cbaufler légèrement vers âO** ou rjô*" avant d'y déposer le liquide de culture.

L'évaporation de la goutte étant terminée, on passe à plusieurs reprises la lame dans la flamme d'une lampe à alcool de façon à la porter à une température un [)eu sui)érieure à 00**. Après refroidissement, on met une ou deux gouttes do solution acpieusc de violet de gentiane à 1 p. 100, et on laisse en contact pendant 5 à 10 minutes. L'excès de matière colorante est ensuite entraîné par un lavage à l'eau distillée; la durée du lavage ne doit pas dépasser une minute avec une préparation en couche mince et régulière, si l'on lient à avoir une coloration intense.

25. La préparation ainsi obtenue peut élre étudiée dans l'eau ou montée après dessiccalion. Pour cette dernière opération, on peut faire usage de baume de Canada; mais cotte substance, em[)loyée seule ou mélangée à un fluidifiant, a l'inconvénient de pfdir la teinte du microbe et de rendre celui-ci moins net, La glycérine le décolore en dissolvant le violet de gentiane; la solution d'acétate de potasse agit de même, quoiqu'à un degré moindre.

Nous préférons faire usage d'une solution concentrée de cblorure de calcium dans laquelle le violet de gentiane est complètement imoluble. Quand on emploie ce dernier liquide, il est 1res avantageux de fixer la préparation, contrairement à l'usage, sur la lame