Journal of ihe Chemical Society, janvier 1878, p

Le tableau ci-dessous donne les volumes de bioxyde d'azote dégagé en présence du protochlorure de fer et de Tacide chlorhydrique, par le nitrate contenu dans Teau sortant des allonges. Le dosage a été fait chaque fois sur 50 centimètres cubes de liquide préalablement concentré par la chaleur :

Le II 1",2 0<^%7

Le 13 0 ,9 1 ,1

Le 16 0 ,7 0 ,7

Le 17 0 ,6 0 ,7

Le 18 0 ,3 0 ,7

Le 19 0 ,4 0 ,4

Le 20 0 ,2 0 ,2

Le 24 0 ,0 0 ,0

Le 26 • . . 0,1 0 ,3

Correspondant à : i

Nitrate de potasse 20"^ 22"«' j

Le volume total du liquide recueilli étant de 450 centimètres cubes, on aurait dû avoir 45 milligrammes de nitrate ; la perte est donc

Pour a de 25'"«*'

Moyenne 24"'«'

Soit 53 p. 100.

Ce chiffre esl un minimum, parce que le nitrate préexistant dans le terreau n'a pas été déterminé.

Cette expérience laisse à désirer, puisque le terreau n'a été ni stérilisé, ni ensemencé; elle montre cependant que la terre végétale renferme normalement les germes de microbes dénitrificants, et que ceux-ci évoluent dés qu'on les confine dans une atmosphère privée d'oxygène libre*. On les voit facilement au microscope dans l'eau

1. Le 20 juillet, rexpérience prouvait déjà qu'il y avait eu dénitrification. Noas eoromuniquAmes le fait, pour prendre date, à la Société des sciences physiques et naturelles de Bordeaux. (Séance du 20 juillet 1882, 2« série, t. V, p. xxxi.)

qui s'écoule des allonges et Ton constate qu'ils ont les formes les plus variées.

117. Le nombre des organismes contenus dans le sol étant considérable, et leurs propriétés très différentes, il était nécessaire d'opérer avec des microbes purs. Nous avons pris pour type le B. deiiUripcans OL dont l'étude a été faite dans les chapitres précédents, et nous l'avons fait agir sur de la terre nitratée seule ou additionnée de matières hydrocarbonées.

118. Le 13 janvier, on remplit des ballons à long col de 500 centimètres cubes environ de capacité avec de la terre de jardin, calcaire, riche en humus et intimement mélangée avec du salpêtre. On ferme ces ballons à la lampe ; on les stérilise et, après refroidissement, on ajoute de la semence prise dans une culture récente.

Les ballons a et a renferment 1 gramme de salpêtre par kilogramme de terre.

Les baillons b et V renferment 10 grammes de salpêtre par kilogramme de terre.

a et b' sont seuls ensemencés ; a et 6 doivent servir de termes de comparaison ; ils sont placés tous les quatre dans une étuve à 35^

Le 23 janvier, on met fin à l'expérience et on dose les nitrates. On trouve :

Nitrate restant dans a H' par kilogr.

— — dansa' 0 ,727 —

— disparu dans d' 0*',273 par Itilogr.

Proportion de sel réduit dans a' . . . . 27.3 p. 100.

Nitrate restant dans 6 10<'' par liilogr.

— — dansé' 8 ,571 —

— dispara dans à' 1 ,429 par Itilogr.

Proportion de sel réduit dans b' . . . . 14.3 p. 100.

Ainsiy en dix jours seulement, le microbe a décomposé une quantité très importante de sel, bien qu'il ait trouvé de mauvaises conditions de développement dans une terre peu humide. Si Ton facilite sa multiplication en ajoutant à la terre, soit de l'eau distillée, soit de Teau sucrée, la dénitrification est beaucoup plus rapide.

119. En même temps que les ballons précédents, on a ensemencé avec le même microbe les ballons suivants qui renfermaient :

a^ de la terre nitratée à l gramme par kilogramme + eau distillée.

a, — à l — — . -+- eau sucrée à 5 p. 100.

b^ — à 10 — — H- eau distillée.

ôî — à 10 — — H- eau sucrée 5 p. 100.

Le 15, couronne de bulles à la surface des liquides dans les quatre ballons.

Par la fermentation, la terre a été soulevée dans tous ; avec Teau sucrée, la mousse a été plus abondante qu'avec l'eau distillée.

Le 16, tout le nitrate est décomposé dans a^ ;

Le 18, tout le nitrate a disparu dans a^ ;

Le 23, on met fin à Texpérience et Ton dose les nitrates ; on obtient par kilogramme de terre :

wiTBATE Dénitrlfication.

restant. disparu. —

Dans a, Néant. U*^ 100.0

— a, Néant. 1 100.0

— ô, Néant. 10 100.0

120. Si Ton rapproche ces résultats de ceux trouvés avec la terre seule (118), on voit que, toutes choses égales d'ailleurs, la décomposition du salpêtre a été plus rapide avec Teau distillée qu'avec la terre seule, plus rapide aussi avec Teau sucrée qu'avec l'eau distillée. L'examen microscopique montre d'ailleurs que le développement du microbe, son abondance et sa jeunesse sont en relation directe avec l'énergie de la réduction.

Le dosage des nitrates dans la terre non ensemencée montre en outre quQ, pendant la durée de l'expérience, les matières organiques n'ont pas réduit le nitrate en l'absence des microbes.

121. Dans rex|)érience que nous venons de résumer, nous n'avons pas fait l'analyse quantitative du gaz dégagé, nous avons simplement vérifié qu'il était composé d'acide carbonique et d'azote.

Pour avoir sa composition exacte, et une fermentation rapide, nous avons employé l'appareil décrit page 302 (fig. 17).

Le 9 juillet, on y a stérilisé :

Terre de jardin, calcaire 100»''

Nilrate de potasse 0 ,50

Sucre de canne 5

Eau distillée q. s.

L'ensemencement a été fait avec du B, denilrificans olj provenant d'une culture récente. La température du bain-marie était de So". La fermentation a été terminée le 20.

Le gaz dégagé est formé de :

Azote 48««,I

Acide carbonique 7 ,9

correspondant à la composition centésimale :

Azote 85.84

Acide carbonique 14.16

On a en outre :

Nitrate disparu 0'%314, soit 62.8 p. 100.

Sacre — Traces.

Le nitrate décomposé aurait dû donner 44 centimètres cubes d'azote, au lieu de 48, volume trouvé.

Celte différence est du même ordre que celle que nous avons constatée dans l'étude de la dénitrification dans les bouillons de culture. Elle est en relation, comme on Ta vu, avec la formation d'une certaine quantité d'ammoniaque aux dépens de la matière organique azotée,

125. Le 30 juillet, on a répété Texpérience avec les mêmes poids relatifs de terre, de salpêtre et de sucre ; cinq jours après, le 4 août, il avait dispai*u 0»%325 de salpêtre, soit 65 p. 100 du sel employé. Ces deux essais, rapprochés de ceux des pages 302 et 303, montrent qu'en se plaçant dans les conditions des expériences de MM. Debérain et Maquenne, notre B. denilrificans peut réaliser ce que n'a pu faire le Bacilltis. amylobacter.

123. Les conditions expérimentales réalisées ci-dessus ne permettent pas de faire circuler des gaz dans la terre végétale et de rechercher rinfluence de l'oxygène sur le microbe dénitrifianl.

Pour résoudre ce problème, et nous rapprocher en même temps davantage des conditions dans lesquelles fonctionnerait ledit microbe, s'il existait seul dans un sol arable humide, nous avons disposé l'appareil de la figure 18 :

La partie essentielle de cet appareil, représentée en triple à gauche de la figure, comprend : un gros tube vertical A, contenant la terre, un réservoir R, où se trouve le liquide nitrate, le récipient B, destiné à recueillir les hquides s'écoulant du tube A.

Le tube A s'engage à la partie inférieure dans un excellent bouchon de liège qui ferme Torifice du récipient B ; il porte à sa partie supérieure un tube recourbé vers le bas et eflSlé en pointe a, et un tube b, muni d'une bourre de coton et relié par un tube de caoutchouc à un petit barboteur D. Le réservoir R, à robinet r, est un cylindre divisé en parties d'égales capacités, comme celui de la figure 16 ; il est fermé en haut par un bouchon conique à recouvrement garni de coton. Son extrémité inférieure pénètre dans la partie supérieure de A; un tube de caoutchouc rend la fermeture hermétique. Le récipient B est fait avec un ballon dont le fond est soudé à un tube en S effilé o et dont le col porte une tubulure latérale 6„ munie aussi d'une bourre de coton et reliée par un tube de caoutchouc à un tube barboteur E contenant de l'eau distillée pour saturer les gaz d'humidité. Le tube plongeant du barboteur est réuni, par l'intermédiaire du robinet i\, à une canalisation de gaz.

Dans la figure, les récipients A et A' communiquent avec un appareil à acide carbonique. A" avec une trompe à air.

Ces trois appareils semblables, placés parallèlement sur un support en bois S, sont déposés à l'intérieur d'une grande étuve en bois dont la double paroi est représentée en C.

L'acide carbonique est produit dans un grand flacon bitubulé F, par la réaction de l'acide chloihydrique étendu sur le marbre. Pour que le courant soit lent et puisse durer plusieurs jours, on fait tomber goutte à goutte l'acide chlorhydrique du flacon de Mariotte H dans le tube à entonnoir G. Le gaz dégagé passe dans un barboteur

RECHERCHES SUH LA RÉDUCTION DBS NITRATES. 317

M avant de se rendre dans les appareils A et A'. Malgré la lenteur de la réaction, le flacon F finit par se remplir d'une solution concentrée : de chlorure de calcium. Pour Tenlever, on ferme un instant les robinets Tj et r/ ; le gaz carbonique comprime le chlorure de calcium et le chasse par le siphon N dans un verre V ; on rétablit Tétai primitif î en rouvrant les robinets r^ et r/.

Le courant d'air est fourni par une trompe à vide T transformée en petite soufflerie à Taide d'une éprouvelte P. L'eau venant da robinet Q s'écoule par la tubulure inférieure de Téprouvette.

Le flacon producteur d'acide carbonique et la trompe soufflante sont extérieurs à Tétuve.

124. Gela posé, il est facile de voir comment circulent les gaz dans nos appareils. L'acide carbonique arrive, par exemple, dans le barboteur E, où l'écoulement est réglé à l'aide du robinet r^ ; puis il pénètre dans le réservoir B, dont le tube o est fermé à la lampe ; s*élè¥c dans la colonne A à travers la terre végétale et s'échappe à l'extérieur par le barboteur D, la pointe a étant aussi fermée à la lampe.

Si le robinet r est ouvert, le Hquide de R s'écoule et tombe à ht surface de la terre ; en descendant, il imprègne celle-ci, se divise i rinfuii, reçoit l'action du courant ascendant de gaz et arrive enfin en B, où il s'accumule.

Pour extraire ce liquide à un moment donné sans démonter l'appareil, on ferme le robinet r, on brise la pointe o et l'on bouche avec le doigt l'orifice du barboteur D ; le gaz continuant à arriver s'accumule en B et force le liquide à sortir par o; on le recueille dans un verre. On remet les choses dans l'état primitif en retirant le doigt et scellant de nouveau à la lampe l'effilure o,

125, Toutes ces manipulations n'ont d'intérêt que si on peut les appliquer à l'étude d'un être vivant unique et maintenu pur pendant toute la durée de l'expérience. Il faut pour cela que l'appareil puisse être stérilisé dans toutes ses parties, que la semence pure puisse y être introduite, que le gaz soit purifié avant d'agir, et enfin que le liquide nitrate ne soit jamais souillé de germes étrangers.

Ces conditions sont toutes réalisables.

Et d'abord, l'ensemble A, B, R peut être stérilisé en entier dans

an autoclave *, à la condition de fermer les orifices o et a. Pendant le refroidissement, Tair extérieur ne peut pénétrer que par les tubulures 6, b^ et par le bouchon conique de R ; partout il se purifie sur du coton calciné. Si les dimensions de cet appareil sont trop grandes pour Tautoclave dont on dispose, on peut le démonter en ses trois parties, en envelopper les extï'émités ouvertes avec une épaisse coudie de ouate, et les stériliser isolément. 11 faudra seulement prendre plus de précautions pour les relier ensuite les unes aux autres. Il faut remarquer que la stérilisation de la terre est une opération difficile qui exige l'action prolongée d'une température élevée.

Quand l'appareil stérilisé est fixé sur son support, on le réunit par m tube de caoutchouc au barboleur E. Pour l'ensemencement, on ^À-^ ferme r^ et on introduit la tubulure a, ouverte avec les précautions habituellQ^, dans le vase contenant la semence ; puis on aspire doucement par l'orifice du barboteur D, au moyen d'un caoutchouc, si cela est nécessaire. On retire ensuite le vase; on flambe la tubulure a et on la scelle à la lampe.

Quant au liquide nitrate, on le prélève avec une pipette flambée éèm le ballon où il a été stérilisé, et on le transporte en R, avec les précautions connues.

Enfin, le gaz carbonique et l'air sont purifiés, avant leur entrée dans l'appareil, par les bourres de coton t^, 6/ et è/'.

En résumé, le dispositif que nous venons de décrire avec détail est d'une manipulation sûre et d'un emploi avantageux pour l'étude physiologique des microbes aérobies au anaérobies, toutes les fois qu'il y a intérêt à multiplier les surfaces de contact d'un liquide de culture et d'un gaz déterminé. Nous l'avons appliqué à la dénitrificalion et à la nitrification. Nous ne parlerons ici que des phénomènes de réduction obtenus avec le B. denUrificans a.

126. Voici comment nous procédons : les tubes A, A', A" reçoivent chacun 70 grammes d'une bonne terre de jardin, calcaire. La terre, préalablement séchée à l'air libre, est tamisée et Ton ne retient que les grains ayant de 2 à 3 millimètres environ de diamètre. Ces

I. La stérilisation dans an poôle à gaz est à peu prés impossible qaand A est garni 4e terre.

dimensions sont convenables pour que liquides et gaz cîrculanl en j sens contraire se trouvent en contact sur une grande surface, et pour que la terre ne se tasse pas par Timbibition. On empêche tout entraînement de matières solides dans les ballons inférieurs en faisant reposer la terre sur une couche de gros grains de carbonate de chaux et ceux-ci sur des fragments de verre.

Après stérilisation de tout l'appareil, on met dans les réservoirs supérieurs R, R', R" de Teau distillée tenant en dissolution 1 gramme par litre de nitrate de potasse, et dans ceux des ballons B, B', B" qui doivent recevoir des liquides fermentes, un volume connu d*une solution étendue de sulfate de cuivre ou de tout autre antiseptique. Cette précaution est indispensable pour empêcher que le nitrate ncm réduit par la terre ne le soit ultérieurement par les organismes entraînés avec le liquide dans les ballons.

Si l'un des appareils n'est pas ensemencé, on ne met pas d'antiseptique dans le ballon correspondant ; l'absence de microbes dans le liquide écoulé est la preuve que la stérilisation avait été bien faite.

127. Le 24 juin, tout étant préparé comme on vient de le dire, on ensemence A et A" avec du B. denUrificans a jeune, et l'on fait cip*. culer de l'acide carbonique dans A et A', de l'air dans A" ; le tube A' non ensemencé doit servir de terme de comparaison. La températurd de l'étuvc est de 35^

A partir de l'ensemencement, on fait écouler dans chaque appareil:

Le 24 juin 10<^ de liquide nitrate.

Le 25 — 5 —

Du 25 juin au 8 juillet : 2''%5 par jour, soit 32 ,5 —

Total 47",5

Le 8 juillet, on met fin à l'expérience. Les poids de nitrate trouvé dons les liquides écoulés sont :

Dans A 46"»',8

On voit tout de suite qu'il y a eu perte de nitrate dans A, et que la présence de l'oxygène n'a point déterminé une nitriûcation sensî-

ble dans A". En prenant la moyenne des nombres obtenus avec A' et X'j on aura le poids de sel entraîné en dissolution, celui auquel il but comparer ^G^^jS pour connaître le poids exact de nitrate réduit, ce qui donne :

Moyenne de A' et de A" 80»»', 3

Nitrate de A 46 ,8

Nitrate réduit 3 S»»', 5

Soit 41 p. 100 du nitrate total, et 480 milligrammes environ par kilogramme de terre.

Dans une autre expérience, au bout de quatre jours, du 17 au : 90 juin, la propoilion de nitrate décomposé dans la terre a été de 19 p. 100.

128- Il résulte de ces expériences et de celles de la page 313 que le B. denitrificans a réduit les nitrates alcalins dans une terre végétale riche en humus, sans qu'il soit nécessaire de lui ajouter des substances étrangères telles que du sucre ou du glucose. Les matières organil qoes de la terre suffisent donc à la nutrition du microbe et leur cai^bone peut être brûlé par l'oxygène de l'acide nitrique.

129. Que ce microbe, ou le D. denitrificans p, ou tout autre semblable, se soit développé dans les expériences de M. Schlœsing

'■ sur la réduction des nitrates dans le sol, et Ton comprendra que la terre ait perdu, comme dans nos bouillons de culture, non seulement tout Tazote de son nitrate, mais encore une partie de celui de ses matières organiques azotées.

130. On comprendra également que lammoniaque formée ne fût pas en proportion équivalente au nitrate réduit, puisque nos expériences nous ont donné :

Pour le B. denitrificans a (page 271).

Ammoniaque correspondant à 1 gramme de nitre . . . 168"*^'', 3

— formée pendant la rédoction 45 ,1

Proportion d*ammoniaque formée 26.8 p. 100

Et pour le B. denitrificans p (page 275) :

Ammoniaque correspondant à 1«^,285 de nitrate . . . 21G'"<S2

— formée pendant la réaction 25 ,4

Proportion d'ammoniaque formée 11.7 p. 100.

AX:C. 8CJRNC£ AQRON. 21

Or, M. Schlœsing a trouvé dans ses deux essais :

Ammoniaque correspondant au nitrate employé . 1528"'' 1262"*',0

— formée pendant la réaction . ... 101 192 ,7

Proportion d'ammoniaque formée 6.6 p. 100. 15,3 p. 100.

L'un de nos nombres est précisément compris entre ceux de M. Schlœsing.

13i. La proportion d'ammoniaque formée pendant la dénitriûcation dépend donc de la nature du microbe et sans nul doute aussi de la composition des matières azotées du sol.

Il est probable que l'origine de cette ammoniaque varie avec les propriétés physiologiques des organismes réducteurs qui vivent dans la terre végétale, et que son azote peut être emprunté soiti l'acide nitrique, soit aux substances organiques azotées. Dans le premier cas, les nitrates ne sont pas détruits en pure perte et sans aucune compensation; dans le second, l'azote organique devient soluble et plus aisément assimilable par les racines des végétaux.

132. La décomposition des nitrates employés comme engrais, on formés par nitrification spontanée, n'est pas à redouter dans une ; terre en bonne culture, labourée souvent, meuble et bien aérée, car l'oxygène y pénètre assez profondément pour empêcher les microbes anaérobies de se développer et d'exercer leur fâcheuse influence réductrice.

Mais si la terre est recouverte d'eau ou simplement imprégnée d'humidité, l'air n'y circule plus librement, et les phénomènes de \ réduction ne tardent pas à apparaître, surtout à la température de l'été. La nature du sol, sa composition chimique, les germes qu'il i renferme, influent naturellement sur la rapidité et sur la nature de < la réaction.

133. Dans ces conditions, la réduction de l'acide nitrique s'an*ête souvent à son premier degré, c'est-à-dire à la formation d'acide nitreux; aussi trouve-t-on presque toujours des nitrites dans les terres humides.

Par les temps secs, la proportion d'acide nitreux va en diminuant à mesure qu'on se rapproche de la surface du terrain; mais ce

n'esl point y comme le pense le colonel Chabrier, parce que « les € oitriles en dissolution dans Tliumidité terrestre sont attirés à la f surface du sol par la capillarité et qu'ils s'y convertissent, au moins € partiellement, en nitrates ^ » ; c'est simplement parce que la dessiccation facilite l'accès de l'oxygène dans des couches de plus en plus profondes où les formes aérobies peuvent seules vivre et déterminer des phénomènes d'oxydation. M. Chabrier en donne lui-même la preuve : < Les nitrites, dit-il, au contact de la terre, ne subsistent € qu'à la faveur d'un grand excès d'eau », c'est-à-dire dans les points où Tair ne peut arriver.

134. En résumé, l'étude que nous venons de faire, bien qu'elle ne s'applique qu'à ([uelques microbes particuliers, démontre que la réduction des nitrates dans les sols est un phénomène corrélatif de la présence, du développement et de la multiplication d'organismes microscopiques pouvant vivre sans oxygène libre.

La connaissance des faits contenus dans ce mémoire devrait toujours guider l'agriculteur dans l'emploi des nitrates comme matières fertilisantes du sol. En se rappelant que ces engrais se décomposent dans les milieux non aérés, il éviterait de les appHquersur des terres trop compactes ou trop humides.

Résumé et concluBionB.

!• Nous avons démontré que la destruction des nitrates, dans les liquides de culture et dans la terre végétale, quel que soit le degré de réduction, n'est point un simple phénomène chimique, mais qu'elle est corrélative de la présence, du développement et de h multiplication des infiniment petits. Elle exige des milieux contenant des matières organiques.

^ Indépendamment des microbes qui ne font que transformer les nitrates en nitrites, nous avons isolé à l'état de pureté deux Bactéries dénîtrifiantes (Baderium deiiitrificaiis a et p) et étudié spécialement les propriétés de l'une d'elles, en insistant sur son aspect, son

1. ÀnnaUê deMmie et de phy;fique, 5« série, t. XXIII, p. 161. 1871.

mode de développement, les milieux qui lui conviennent, et sur les circonstances qui favorisent son activité et ses propriétés réductrices. 3*" Nos deux microbes se multiplient avec la même facilité dans les bouillons de viande et dans le liquide artificiel suivant :

Nitrate de potasse I0«',00

Acide citrique 7 00

Asparagine 5 00

rhospbate de potasse 5 00

Sulfate de magnésie 5 00

Chlorure de calcium cristallisé 0 50

Sulfate de protoxyde de fer 0 OS

Sulfate d'alumine 0 02

Silicate de soude 0 02

Ammoniaque, pour neutraliser q. s.

Eau pour compléter le volume à 1000^**

4** Les vapeurs de mercure nuisent au développement des Bacterium denitrificans, tandis que Tacide salicylique et l'acide phénique | sont sans action antiseptique sur ces deux organismes.

5"" Nous avons montré que, suivant la composition du milieu nutritif, l'azote de l'acide nitrique se dégage seul ou mélangé à du protoxyde d'azote. La tempéraUire, la concentration des liqueurs, la ! quantité de semence font varier la proportion de protoxyde d'azote.

6° L'oxygène de l'acide nitrique, qui ne reste pas combiné avec ■• l'azote dans le protoxyde, binile le carbone de la matière organique, et donne de l'acide carbonicjue qui se dissout en grande partie i l'état de bicarbonate de potasse.

7* Si la matière organique est azotée, comme dans le bouillon de viande, il y a formation d'ammoniaque et dégagement d'un léger excès de gaz azote qui s'ajoute à celui du nitrate.

8° Les résultats obtenus dans les liquides de culture ont été étendus à la terre végétale. Cette application rend compte, non seulement des phénomènes de dénitrification constatés dans le sol, mais encore de toutes les particularités signalées par M. Schlœsing.

9" En cherchant à nous rendre compte du mécanisme de la déni- ■^ trification par les /?. denitrificans, nous avons été amenés à étudier I l'action de l'hydrogène naissant sur les nitrates. Nous avons montré que le BaciUus amylobacler peut dégager de grandes cjuantités

d'hydrogène dans la fermentation butyrique du sucre, du glucose ou de l'amidon, et néanmoins ne réduire que de très petites quantités de nitrate de potasse.

10* Nous pensons que la différence d'énergie réductrice de ces divers organismes est due à la quantité totale de chaleur mise à leur disposition par l'ensemble des réactions chimiques, et surtout à la différence de leurs exigences thermiques, lorsqu'ils jouent le rôle de ferments.

41* La décomposition des nitrates par le B. denitrificans n'est ni une fermentation proprement dite, ni un phénomène secondaire, c'est une combustion des matières organiques par l'oxygène nitrique, produite avec dégagement d'une grande quantité de chaleur.

C'est le type de fermentations qui ne peuvent s'accomplir quq par le concours simultané de plusieurs réactions chimiques.