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Méthode biochimique (1). — Cette méthode est basée sur la propriété spécifique, que possèdent certains ferments solubles, d'hydrolyser des sucres et des glucosides en solution aqueuse. Gette hydrolyse se traduit à nous par les changements des propriétés physiques (optiques) et chimiques (réductrices) des liquides. Les ferments sont ainsi utilisés pour produire des réactions chimiques, et c’est pour cela qu'on a appelé la méthode, méthode biochimique.

Avant d'exposer son principe, tel qu’il a été précisé en ces derniers temps, il est nécessaire de rappeler quelquesunes des connaissances déjà acquises sur les deux ferments, invertine et émulsine, dont elle met à profit les propriétés.

Le ferment désigné sous le nom d’invertine a été découvert par MirscnerLicx , c'est une poudre qu’on peut obtenir sans mélange d’autres ferments en tuant, par l'alcool, la levüre de bière des boulangers ou levüre haute, fraiche, en employant le procédé indiqué par M. BOURQUELOT.

C’est le réactif par excellence du sucre de canne libre ou combiné à d’autres sucres, comme dans le gentianose, le raffinose, le stachyose, le verbascose, par exemple, Dans tous les cas, son action est limitée à la séparation du groupement lévulose.

L'émulisine préparée avec des amandes douces, d’après le procédé donné par M. HérisseY (2), est un mélange de plusieurs ferments. On y a signalé, outre l’émulsine proprement dite, d’autres ferments hydrolysants de certains sucres comme le lactose, le gentiobiose (3), le mélibiose et le manninotriose (4).

(1) C. R. Ac. des Sciences, CXXXIII, p. 690, 1901 ; et : Sur l'emploi des enzymes comme réactifs dans les recherches de laboratoire. Enzymes hydratants (hydratases). Journ. de Pharm. et de Chim. (6) XXV, p. 16 el 378, 1907).

(2) Recherches sur l’émulsine. Thèse docl. Univ.(Pharmacie) Paris, 1899

(3) Em. BourQuELOT et H. Hérissey. — C. R.Soc.de Biol. p. 213, 1903.

(4) J. VINTILESCO. — Etude de l’action des ferments sur le stachyose. çJourn. de Pharm. et de Chim. (6) XXX, p. 167, 1909).

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Pour employer ces deux ferments, il faut d'abord préparer, avec la plante à essayer, un extrait liquide.

La plante à étudier doit être traitée fraiche, la dessiccation entrainant souvent une destruction partielle des sucres et des glucosides. On divise grossièrement deux ou trois cents grammes du végétal et on projette au fur et à mesure les fragments dans de l'alcool à 90c bouillant, qu’on a additionné, au préalable, d’une petite quantité de carbonate de calcium. L'emploi de l’alcool bouillant a pour but de tuer les ferments hydrolysants qui existent dans les végétaux et qui sont susceptibles d’hydrolyser les sucres et les glucosides ; l'addition de carbonate de calcium est nécessaire pour saturer les acides organiques qui pourraient également amener le dédoublement de ces principes.

On relie le ballon à un réfrigérant à reflux et on continue l’ébullition pendant 20 à 30 minutes.

Après refroidissement, on broie la plante et on lui fait subir un deuxième traitement à l’alcool bouillant, de façon à l’épuiser complètement.

On exprime à la presse, on filtre et on distille le liquide alcoolique à sec, sous pression réduite ; on reprend le résidu par de l’eau thymolée, à chaud ; on laisse refroidir et on filtre. On complète le volume avec de l’eau thymolée, de façon que 100 cm* de liquide obtenu correspondent à 100 gr. de végétal essayé.

On défèque une partie du liquide au sous-acétate de plomb ; on en fait alors l'examen polarimétrique et on y dose le sucre réducteur.

Au reste du liquide, on ajoute de l’invertine, dans la proportion de 0 gr. 50 à 1 gr. pour 100 cmÿ ; on porte à l’étuve à + 30°-35°,

On fait,tous les jours, l'examen polarimétrique du liquide et on y dose le sucre réducteur, après défécation comme dans le premier cas. Quand on a obtenu les mêmes chiffres

deux jours de suite, c’est que l’action du ferment est terminée.

La plante contient-elle du saccharose ou un autre sucre renfermant du lévulose uni à du glucose, on constate un recul de la déviation vers la gauche et une augmentation de sucre réducteur. Si le sucre rencontré est du saccharose, les changements optiques observés coïncident avec ceux qu'indique le calcul, en considérant le sucre réducteur formé comme du sucre interverti.

On porte alors le liquide au bain-marie bouillant, en vase clos, pendant 16 à 20 minutes, pour détruire l’invertine. Après refroidissement, on ajoute de l’émulsine, dans la proportion de 0 gr. 25 pour 100 em? de liquide et on replace le flacon à l’étuve.

Les jours suivants, on renouvelle, après défécation préalable, l'examen du liquide au polarimètre et le dosage du sucre réducteur. Si on constate un retour de la déviation polarimétrique vers la droite, et une augmentation du sucre réducteur, on peut conclure à la présence d’un glucoside lévogyre dérivé du glucose. Ce changement est généralement rapide ; cependant, l’action hydrolysante du ferment peut être retardée pour diverses causes, mais,avec la plupart des glucosides, il suffit d’une action de 5 à 6 jours pour qu'ils soient entièrement hydrolysés.

Si la plante contient un sucre comme le raflinose, le stachyose ou le verbascose, en même temps qu’un glucoside, on constate alors que la déviation, après avoir subi le retour à droite, recule de nouveau lentement ; en même temps, la quantité de sucre réducteur augmente. Ce second changement est dù à l'hydrolyse des sueres nouveaux mis en liberté par l’invertine : mélibiose etc... , hydrolyse due à des ferments spéciaux que l’on rencontre dans l’émulsine.

On conçoit aussi que, parfois, le retour et le recul puissent se superposer ; la déviation ne changera pas, tandis

que la quantité de sucre réducteur augmentera. Nou$ avons rencontré ce cas tout à fait spécial, M. BOURQUELOT et moi,dans la graine d'Entada scandens Benth. (1).

Mais, dans la généralité des cas, le glucoside existe dans les plantes sans être accompagné d’un de ces sucres dont la présence complique le problème.

Quand le glucoside est seul, on peut avoir d’utiles indications en établissant le rapport qui existe entre le retour de la déviation vers la droite et la quantité de sucre réducteur formé. C’est ce rapport, exprimant en milhgrammes la quantité de sucre réducteur formé pour un retour de 1°, que M. BourqQuELoT appelle indice de réduclion enzymolytique (2).

Cet indice de réduction constitue une constante caractéristique de chaque glucoside et permet de reconnaître si on est, dans une plante, en présence d’un glucoside connu, et si ce glucoside y est seul.

Le dosage du-sucre réducteur se fait habituellement en faisant tomber directement la solution goutte à goutte dans la liqueur de Fehling, portée à l’ébullition ; le terme de la réaction est marqué par la décoloration totale de la liqueur cupro-potassique, après dépôt de l’oxyde de cuivre formé.

Les liquides extractifs dans lesquels il faut faire le dosage sont généralement colorés en jaune, et la fin de la réaction est difficile à saisir. C’est pourquoi, ayant besoin de dosages très précis, j'ai abandonné cette ancienne méthode. J'ai eu recours à un procédé de dosage indirect dont

(1) Em. BOURQUELOT et M. BRIDEL. — Sur la recherche du raffinose dans les végétaux. Sa présence dans deux graines de Légumineuses : Erythrina fusca Lour. et Entada scandens Benth. (Journ. de Pharm. et de Chim. (6) XXX, p. 162, 1909).

(2) Em. BOURQUELOT. — Nouvelle contribution à la méthode biochimique de recherche, dans les végétaux, des glucosides hydrolysables pay l’'émulsine: son application à l'étude ee plantes employées en médecine populaire. (Journ. de Pharm. el de Chim. (7) IX, p. 241, 1910).

le principe a été autrefois indiqué par Mon (1). Ce principe est le suivant :

On dissout l’oxydule de cuivre dans une solution acide de sulfate ferrique ; il passe à l’état de sulfate de cuivre et une quantité correspondante de sel ferrique est réduite à l’état de sel ferreux.

Cu°0 + (SOH5Fe2 + SOH2= 2S04Cu + 2S04Fe -+ HO.

On dose alors le sel ferreux à l’aide d’une solution de permanganate de potassium titrée et on calcule le poids de cuivre réduit correspondant.

En 1906, M. G. BerrranD (2) a précisé les détails techniques de cette méthode et publié des tables indiquant, de milligramme en milligramme, les quantités des principaux sucres réducteurs correspondant aux poids de cuivre trouvés, En suivant la technique de BerrrAND, cette méthode donne des résultats d’une grande précision ; tous les dosages de sucre réducteur que j'ai faits dans ce travail l’ont été en utilisant ce procédé, qui n’est d’ailleurs pas plus long que le procédé ordinaire à la liqueur de Fehling.

Mon travail se divise en deux parties :

Dans la première partie, j’étudierai la composition de la racine de Gentiane fraiche et de la racire désséchée à l'air.

Dans la deuxième, se trouvera l’étude des préparations galéniques de Gentiane obtenues avec une racine desséchée sans lui faire subir de fermentation.

La première partie est subdivisée en 3 chapitres.

Le premier est une revue de l’état actuel de nos connaissances sur les principes immédiats contenus dans la Gentiane.

(1) Zeit. f. analyt. Chim., XII, p. 296, 1873.

/2) Le dosage des sucres réducteurs (Bull. Soc. Chimique (3), XXXV, XXXVI, p. 1287; 1906).

Dans le deuxième, j'exposerai les résultats du travail que j'ai fait en 1910,en collaboration avec M. BOuRQUELOT.

Dans le troisième, on étudiera les variations dans la composition de la racine fraiche au cours de la végétation d'une année, puis le dosage des principes immédiats dans la racine séchée sans fermentation.

La deuxième partie est subdivisée en 5 chapitres :

Dans le chapitre 1, on trouvera l’étude de la composition des teintures préparées par deux procédés, teinture à froid, teinture à chaud.

Le chapitre II sera consacré à l’étude de Paction de l'émulsine sur la gentiopicrine,en milieu alcoolique, étude qui découle tout naturellement des résultats qui ont été obtenus dans le chapitre précédent, et qui les explique.

Dans le chapitre III, viendra se placer l'étude de la composition des teintures de Gentiane préparées par macération, avec de l’alcool à 95c, et par lixiviation avec de Palcool à 60€, dans le but d'éviter l’hydrolyse de la gentiopicrine pendant la préparation même.

Dans le chapitre IV, on trouvera l'étude d’un extrait aqueux préparé conformément au Codex de 1908, l'étude d’un extrait alcoolique préparé par lixiviation avec de l'alcool à 60c, et celle du vin ét du sirop de Gentiane.

Dans le chapitre V, on s’occupera de la conservation de certaines de ces préparations galéniques, notamment de la poudre et des teintures.

Enfin, un dernier chapitre sera réservé aux conclusions que peut tirer de cette étude.

Tout ce travail a été accompli dans le laboratoire de M. le Professeur BourquEeLor. C’est grâce aux excellents conseils et aux nombreux encouragements que ce Maître bienveillant m'a toujours prodigués pendant cinq années de travail à ses côtés que j'ai pu mener à bien cette tâche que Je m'étais assumée. Aussi, je suis heureux de pouvoir

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lui témoigner ici l'expression de ma profonde reconnaissance et de mon respectueux attachement.

Je dois remercier aussi M. le Professeur agrégé HéRisseY qui, en maintes circonstances, m'a donné des conseils dont j'ai pu apprécier l'utilité.

Les racines de Gentiane qui m'ont servi au cours de ce travail m'ont toutes été envoyées fraiches, de Gérardmer, par mon aimable confrère M. Dufour qui s'était gracieusement mis à ma disposition. Je suis heureux de lui adresser ici mes meilleurs et mes plus sincères remerciements, et Je le prie de croire à toute ma gratitude.