I. — LE POISON DE LA DIPHTÉRIE

Les cultures du bacille diphtérique ont été faites sur le milieu indiqué plus haut, contenant du lactate d'ammoniaque, seulement. Le bacille y pousse assez bien, mais il se développe encore mieux lorsque, à côté du lactate d'ammoniaque, le liquide renferme encore 0,5 p. 100 d'urée, 0,002 p. 100 d'ac. urique et0,5àl p. 100 de sucre de canne. Le développement de la culture devient perceptible du 3* au 4' jour après l'ensemencement : la culture pousse assez bien et son aspect diffère peu de celui des cultures sur bouillon. Le bacille se développe à la surface et dans la partie supérieure du liquide; les couches de bacilles développés tombent ensuite au fond du liquide où elles forment des espèces de flocons. Le développement se faisait encore mieux dans le liquide un peu fortement alcalinisé : dans ces conditions il se formait, au moment de Talcalinisation, un précipité de sel de chaux qui diminuait à mesure que la culture se développait. Mais jamais, même dans ces conditions, les cultures n'étaient aussi abondantes que lorsque le bacille est cultivé sur bouillon. Les cultures sur

mon milieu étaient ordinairement maintenues pendant 3 semaines et demie à 4 semaines, à Tétuve.

Pour Tensemencement de mon milieu, je me servais de cultures sur bouillon très toxiques. Leur toxicité était telle que 2à 3cc. d'une culture vieille de 2 jours inoculés sous la peau suffisaient pour tuer le cobaye au bout de 24 heures ; 2 à4 ce. d'une culture vieille de 3 semaines et filtrée à travers le filtre Chamberland tuaient le cobaye dans le même laps de temps.

Les cultures du bacille diphtérique sur nos milieux possédaient une toxicité moindre, dont le degré variait du reste avec la composition du milieu. Ainsi 13 ce. d'une culture sur le milieu ne contenant que du lactate d'ammoniaque, tuaient le cobaye en injection sous-cutanée dans l'espace de 48 heures. La même culture filtrée sur filtre Chamberland, introduite dans le péritoine du cobaye, tuait l'animal en 3 ou 4 jours à la. dose de 20 ce. Avec des cultures faites sur le milieu qui, à cAté du lactate d'ammoniaque, contenait encore de l'urée, il suffisait, quand elles étaient filtrées, de 8 ce. pour tuer l'animal en 48 heures quand l'injection était faite sous la peau, et de 13 h 15 ce. pour emporter le cobaye dans l'espace de 3 à 4 jours quand l'injection était faite dans le péritoine. Quand je me servais des cultures faites sur le milieu contenant, à côté du lactate, encore 0,8 p. 100 d'urée, et 1 p. 100 de peptone, la mort du cobaye pouvait être provoquée avec 1,5 ce. injecté sous la peau. L'atténuation de la virulence ainsi obte* nue n'était du reste pas permanente, fixe. Il suffisait d'ensemencer ces cultures affaiblies sur du bouillon ordinaire pour obtenir de très belles cultures qui, vieilles de 2 jours, tuaient le cobaye en 30 à 34 heures à la dose de 3 à 3 ce. sous la peau. On voit donc que, bien que la toxicité des cultures de la diphtérie soit en rapport direct avec la composition du milieu nutritif, les toxines, ainsi que l'a déjà montré Guino* chet, ne proviennent pas de la décomposition des corps albuminoïdes du milieu nutritif. Il s'agit là d'un produit élaboré par les microbes, d'un produit de synthèse.

Comme Guinochet, j'ai cultivé le bacille diphtérique dauâ de l'urine ne contenant pas de traces d'albumine. Les cultures poussaient assez bien, mais leur toxicité ne dépas*

300 OUGHmSKY.

sait pas sensiblement celle des cultures faites sur mes autres milieux : 12 à IS ce. de cette culture filtrée était la dose mortelle pour le cobaye qu'elle tuait en 3 à 5 jours.

Mes cultures évaporées dans le vide à 38-40* et réduites au tiers ou au quart de leur volume primitif, donnaient les. réactions colorantes des corps albuminoïdes (réaction du biuret, de Millon, xanthoprotéique). Les colorations étaient faibles, mais elles existaient toujours. L'alcool absolu y formait un précipité faible, ainsi que le sublimé, le ts^nin. Quant au sulfate d'ammoniaque, il était difficile de dire s'il formait ou non de précipité. Quand le précipité paraissait exister et qu'après filtration on le faisait dissoudre dans l'eau pure ou l'eau légèrement alcalinisée, la solution ne présentait pas, à la vérité, les réactions des substances albuminoïdes, mais on ne pouvait pas s'assurer de sa toxicité, le sulfate d'ammoniaque étant déjà toxique par lui-même. La dialyse, pour séparer complètement l'acide sulfurique, demandait 3 à 4 jours, et au bout de ce temps le liquide qui avait été soumis à la dialyse n'était plus toxique, soit que, dès le début, il ne contînt pas de poison, soit que celui-ci eût été détruit par l'air; peut-être aussi le poison de la diphtérie traversait-il le dialysateur, fait qui a été démontré par Roux et Yersin.

Pour compléter (mon étude sur le poison diphtérique, j'ai fait une série de recherches sur des cultures très toxiques sur bouillon ordinaire, cultures filtrées.

Le poison de ces cultures n'était précipité ni par SO* Mg, ni par SO* Na', ni par Cl Na. On pouvait le précipiter par l'acétate de plomb, le sublimé, et par l'alcool qui est généralement employé comme l'agent de précipitation le plus commode pour les poisons bactériens et dont je me servais aussi de préférence aux autres.

Tous les corps albuminoïdes ne se comportent pas de la même façon envers l'alcool ^ Les albumines, les globulines, sont précipitées par l'alcool faible, mais elles se coagulent et Jeviennent insolubles quand elles séjournent pendant quel-

- 1. Armand Gautier, Chimie biologique*

que temps dans ralcool absolu. Les coUagënes et les substances albuminoïdes (mucine, etc.) ne sont pas non plus solubles dans Talcool même faible, mais Talcool absolu ne les coagule pas. Les alcali-albumines et les syntonines.sont en partie solubles dans Talcool faible, qui ne les coagule pas. Enfin les propeptones sont solubles dans l'alcool à SO-SS"*, et le peptone dans l'alcool à 65-70°.

J'ai essayé d'utiliser ces propriétés de l'alcool pour l'étude du poison diphtérique, en procédant de la façon suivante :

1. 40 ce. d'une culture sur bouillon âgée de 3 semaines et filtrée^dont 2 à 3 ce. tuent un cobaye en 24 heures, sont traités par 300 ce. d'alcool absolu , en laissant tomber goutte à goutte la culture dans l'alcool. La culture reste dans Talcool pendant cinq jours, pendant lesquels Talcool estchangé deux fois. Le précipité qui s'était formé est alors séché à 36*" et dissous dans 40 ce. d'eau stérilisée. La solution est ensuite filtrée, et on constate que le filtre retient des parcelles' d'une matière insoluble. Le liquide qui passe à travers le filtre possède les belles réactions colorantes des albuminoïdes (réaction du biuret, xanthoprotéique, de Millon, d'Adamkiewicz) et tue un cobaye en 24 heures à la dose de 4 ce. Le poison n'a donc pas été affaibli par la filtration, d'où on peut conclure que les traces d'albumine restées peut-être insolubles n'ont aucun rapport avec le poison.

II a). 45 ce. de la même culture sont traités par 50 ce. d'alcool à 95°. Il se forme un léger précipité qui est séché puis dissous dans 40 ce. d*eau stérilisée. 1 ce. de la solution injectée sous la peau d'un cobaye fait périr l'animal au bout de huit jours, et à l'autopsie on trouve les lésions caractéristiques de la diphtérie expérimentale (pleurésie, pneumonie, dégénérescence graisseuse du foie). La solution possédait à un faible degré les réactions colorantes des corps albuminoïdes.

à). On ajoute au liquide*, débarrassé par filtration du précipité, encore 30 ce. d'alcool à 95°. La teneur du mélange im alcool est donc de 65°. 11 se produit un nouveau précipité Py qui est séché et dissous dans 40 ce. d'eau distillée. Cette solution présente d'une façon plus accusée que les premières

302 OUGHINSKY.

solutions les réactions colorantes des substances albumino!* des et tue les cobayes en trois jours à la dose de i ce.

c). Le liquide obtenu après séparation du précipité ^ est additionné d'une quantité d'alcool absolu telle que la teneur du liquide en alcool se trouve portée à 82 p. 100. Il se forme un nouveau précipité abondant, qui est séché à 36", puis dissous dans 40 ce. d'eau. La solution donne d'une façon très nette les réactions caractéristiques des substances albàminoïdes et tue un cobaye en 28-30 heures à la dose de 1 ce. On sait que, d'après Brieger et FraBukel, il ne resterait pas de poison dans le bouillon additionné d'une quantité d'alcool absolu telle que la teneur du mélange en alcool se trouve portée à 75'.

On voit donc que le poison diphtérique ne peut pas être une albumine, puisqu'il n'est précipité que par l'alcool fort et qu'il se dissout dans l'alcool absolu. Abandonné dans l'alcool absolu, il se détruit peu à peu, et deux à trois semaines après un tel séjour il est facile de constater que son action est déjà affaiblie. Ce poison se dissout dans l'alcool à 45-55® et n'est entièrement précipité que par l'alcool à 70-80". Quand il s'est développé dans un milieu dépourvu de substances albuminoïdes, il n'en est précipité qu'à la condition d'ajouter au liquide une quantité d'alcool telle que le mélange arrive à contenir 70 à 80 p. 100 d'alcool. Ce fait vient donc à l'appui de l'hypothèse d'après laquelle le poison des cultures sur bouillon serait simplement entraîné par le précipité d'albumine. Le pouvoir toxique du précipité provoqué par l'addition d'alcool au bouillon diphtérique correspond à celui de la quantité des corps albuminoïdes précipités par l'alcool de 45-60*.

La propriété du poison diphtéritique d'être entraîné par les précipités qui se forment dans le bouillon a été établie par Roux et Yersin. J'ai essayé à mon tour d'entraîner le poison en formant dans la culture filtrée un précipité de cholestérine, de collodion, de photoxyline. Toutes ces substances étaient dissoutes dans l'éther ou dans un mélange d'éther ou d'alcool absolu. En agitant une petite quantité d'une telle solution saturée avec des liquides aqueux, on obtient un précipité capable d'entraîner les ferments (méthode de Brucke et de Danilevski pour précipiter les ferments). Le précipité

ainsi obtenu était bien lavé, puis de nouveau dissous dans Téther ou dans un mélange d'éther et d'alcool absolu, ensuite filtré. Le résidu était alors séché et repris par Teau alcalinisée par l'addition de 0,004 p. 100 de potasse caustique.

Ceprocédé ne me permit pourtant pas d^éliminer le poison, et malgré toutes ces manipulations, le bouillon restait aussi toxique qu'auparavant. J'eus alors recours à la méthode suivie par Roux et Yersin, c'est-à-dire à l'élimination du poison par le phosphate de chaux. Mais les précipités que j'obtenais de celte façon étaient bien moins toxiques que le bouillon dans lequel ils ont été formés. Ainsi, quand 0,2 à 0,3 ce. de bouillon tuaient un cobaye en 24 heures, la quantité de précipité phosphato-calcique nécessaire pour tuer un cobaye en 24-48 heures devait correspondre à 5 ou 6 ce. de bouillon,

J'ai essayé aussi d'isoler du précipité phosphato-calcique le poison spécifique à l'état de pureté, en procédant de la façon suivante : Après avoir bien lavé le précipité, je l'agitais, sans l'avoir séché, sous l'eau dans laquelle je faisais passer un courant d'acide carbonique. Au bout de quelque temps, le précipité était dissous. La solution était alors évaporée à sec dans le vide, sur de l'acide sulfurique : dans ces conditions, le précipité perdait l'aspect floconneux et visqueux qu'on lui connaît dans le bouillon, et devenait très fin, pulvérulent. Le résidu était alors traité par une solution de bicarbonate de soude à 0,5-1 p. 100,ouparla potasse caustique à 0,004 p. 000. J'obtenais ainsi un liquide qui présentait à un faible degré la réaction de Millon, xanthoprotéique, et possédait une toxicité égale à celle du précipité phosphato-calcique.

De tous ces faits je me crois autorisé à conclure que le poison de la diphtérie appartient au groupe des corps albuminoïdes, dont, du moins, il possède les réactions colorantes ; qu'il est précipité par le sublimé, l'acétate de plomb, Talcool fort; qu'il est soluble dans l'alcool faible; qu'il n'est pas précipité par leferrocyanure de potasse acétique.

Il me semble donc que le poison diphtérique peut être rapproché des peptones ou des corps encore plus hydratés et décomposés qui d'un côté ont conservé certaines propriétés des corps albuminoides et,'de l'autre, se rapprochent des pro-

304 0UCHIM8KY.

duits de leur décomposition. Ceci nous explique la facilité avec laquelle on trouve des ptomaïnes dans des cas semblables.

Comme.je Tai dit plus haut, le poison en question est élaboré, peut-être excrété, par le bacille. Or les produits d'excrétion ne sont jamais d'une composition très complexe, ne sont pas le résultat d'une synthèse élevée, comme le sont par exemple les nucléo-albumines : au contraire, dans tous ces cas il s'agit plutôt de produits de désintégration.

La connaissance exacte de ce poison, qu'on a, non sans raison, comparé aux enzymes, avec lesquelles il a un grand nombre de points de contact (action toxique à des quantités impondérables, propriété d'être entraîné avec les précipités, faible résistance envers certaines substances), nous permettra peut-être un jour de connaître plus intimement la nature des ferments. En effet, c'est dans les conditions que nous venons d'indiquer que nous pouvons obtenir ces substances à l'état de pureté, non mélangées à des corps albuminoïdes qui gênent tant dans l'étude chimique de ces substances.