Bulletin de la Société de biologie ^ juillet

Deux centimètres cubes injectés sous la peau suffisent d*ordinaire à tuer un cobaye de poids moyen. Lorsqu'on a soin de ne pas dépasser les doses maniables, on arrive à vacciner le cobaye très vite et très sûrement.

Nous demandons la permission d'ouvrir ici une parenthèse et d'indiquer rapidement les effets que nous avons obtenus avec cette vibrionine sur le cobaye tuberculeux. M. Gamaleïa a depuis longtemps signalé, on le sait, la susceptibilité extrême des cobayes tuberculeux pour le vibrion avicide; il était intéressant de voir comment ils réagiraient vis-à-vis de cette vibrionine.

Après avoir pris pendant plusieurs jours la température d'un cobaye manifestement tuberculeux (température qui oscillait entre 38",2 et 38",4), nous lui avons injecté un centimètre cube et demi de l'extrait glycérine. L'animal a présenté une réaction générale qui s'est traduite par une élévation de la température, laquelle au bout de quelques heures est retombée au-dessous de la normale. Ainsi l'injection a été faite à une heure et demie; la température était de 38*", 4.

On notait à 2 h. 1/2 39»,2.

— à 6 heures 37»,8,

Le lendemain l'animal avait succombé. A l'autopsie il n'existe aucune lésion locale au niveau du point d'injection ; mais le chancre tuberculeux est le siège d'une rougeur Uitense, d'un suintement très abondant, d'une exsudation croûteuse. Toute la chaîne des ganglions caséeux qui s'échelonnent au-dessus du chancre est tuméfiée; les ganglions sont noirs tant ils sont gorgés de sang. Les poumons remplis de masses caséeuses sont très congestionnés et cette hyperémie va jusqu'à Thémorrhagie pulmonaire. Le foie, la rate et les capsules surrénales, tous organes farcis de tubercules, sont le siège d'une congestion intense.

Dans une autre expérience, nous avons cherché à comparer la toxicité de notre extrait glycérine chez le cobaye sain et chez le cobaye tuberculeux, en injectant à chacun un

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centimètre cube et quart de vibrionine. Voici d'abord la marche de la température :

Cobaye normal 39» — 38»,8 — 37»,9.

— . tuberculeux 39^,7 — 39^,5 — 38»,8.

Le cobaye tuberculeux meurt au bout de trente-six heures, tandis que le cobaye sain reste bien portant. L'autopsie nous a montré des lésions pérituberculeuses tout à fait analogues à celles que nous avons décrites ci-dessus.

Ainsi, chez le cobaye tuberculeux la vibrionine détermine une réaction à la fois locale et générale ; cet extrait est beaucoup plus toxique pour le cobaye tuberculeux que pour le cobaye sain. Ce qui différencie Faction élective de cette vibrionine de la tuberculine, c'est le peu d'intensité de la réaction générale, de la fiëvre.

Revenons à la vaccination.

Nous venons de montrer qu'il est facile au moyen des vaccins chimiques de rendre l'animal réfractaire au vibrion avicide ; la culture stérilisée soit par la chaleur, soit parles essences, la culture filtrée à la bougie, les produits volatils, l'extrait glycérine renferment tous la substance vaccinale. Celle-ci supporte bien une température de 130'' pendant une demiheure; il s'agirait donc, semble-t-il, d'une substance résistante. Aussi était-il légitime d'espérer qu'ayant affaire à un produit stable, il serait possible, sinon d'obtenir la substance vaccinante à l'état de pureté, du moins d'obtenir quelques notions sur sa nature et de la caractériser par quelques réactions. C'est ce que nous avons essayé de faire.

La culture du vibrion avicide dans le bouillon de pieds de veau donne une réaction alcaline des plus prononcées ; la culture, tout en ayant une odeur sui generis des plus marquées présente en outre une odeur ammoniacale ; il suffit de chauffer la culture pour que des vapeurs d'ammoniaque s'en dégagent.

Cette alcalinité considérable du bouillon de culture nous a fait penser que la substance vaccinale était peut-être une base alcaloïdique ; c'est de ce côté que nous avons d'abord dirigé nos recherches. Nous nous sommes servi pour cela de la méthode de M. Gautier. Après avoir par une évaporation légère

ehassé la majeure partie de rammoniaque, nous avons traité notre milieu de culture par Tacétate de plomb, qui y a déterminé un précipité très sJbondant. Après filtration nous avons déplacé Texcès de plomb par une solution d'acide oxalique. Puis nous avons filtré notre liquide et évaporé lentement de façon à chasser les acides gras volatils ; enfin pour conserver nos bases à Tétat de sels, nous avions soin d'ajouter de temps en temps quelques gouttes de la solution d'acide oxalique. Lorsque notre liquide était réduit environ au dixième, nous avons traité par un lait de chaux très clair pour enlever la majeure partie, mais non la totalité de Tacide oxalique (il faut que le liquide reste légèrement acide) ; nous avons alors évaporé à siccité.

C'est avec le résidu ainsi obtenu que nous avons fait un grand nombre d'expériences. Lorsqu'on dilue ce produit avec un peu d'eau stérilisée et qu'on le neutralise avec une solution de carbonate de soude, on constate que cette dilution est bien tolérée par le cobaye, qui n'éprouve aucun phénomène dHntoxication et qui ne présente que très exceptionnellement d'accident local au niveau du point d'injection. Ce premier point est très intéressant à mettre en relief; car, ainsi que M. Gamaleïa l'avait montré, ainsi que M. Wolkow * Ta établi dans un récent travail très complet, les cultures du vibrion avicide sont extrêmement toxiques. Or, il semble résulter de nos recherches, que la précipitation par un sel de plomb débarrasse le milieu de culture de la majeure partie des substances toxiques. On obtiendrait ainsi une dissociation entre les substances vaccinantes et toxiques.

Le résidu ainsi préparé possède de remarquables propriétés vaccinales. Tous les essais que nous avons faits, et ils ont porté au moins sur une vingtaine de cobayes, ont donné des résultats positifs des plus nets. Nous avons commencé par injecter une dose du résidu tous les deux jours, parfois chaque jour, sous la peau du cobaye, renouvelant cette injection cinq, quatre, trois, deux fois seulement. Toujours les animaux ont résisté à une dose de vibrio virulent double et triple de la

(1). Ai^h. de méd. expéf'imentale (1892).

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dose mortelle. Les cobayes ont supporté cette dose énorme sans en être sensiblement incommodés; ils présentaient à peine un peu d'œdème au point d'inoculation et étaient complètement rétablis dès le lendemain.

Nous sommes même arrivé dans deux tentatives à vacciner le cobaye après une seule injection de notre produit; il a été contrôlé au bout de vingt-quatre heures avec plein succès.

Nous avons enfin cherché si cet extrait ne possédait pas la propriété de guérir Tinfection vibrionienne ; nous avons pour cela injecté à un cobaye quelques gouttes de notre culture virulente et un quart d'heure après la substance .vaccinale ; ranimai a succombé, mais après une survie de six heures sur le témoin.

En présence de résultats aussi nets, nous nous sommes demandé si une substance quelconque entrant dans la composition de notre milieu de culture ne possédait pas également des propriétés immunisantes. A cet effet, nous avons fait quelques tentatives de vaccination avec une solution de chlorure de sodium stérilisée, avec un extrait concentré de bouillon de pieds de veau non ensemencé ; aucun de ces produits ne vaccine. C'est donc bien aux échanges nutritifs corrélatifs de la vie du vibrio, c'est aux sécrétions du microbe qu'appartient le pouvoir de conférer l'immunité. Cette immunité est acquise très rapidement; deux ou trois jours, un jour même après l'introduction des substances vaccinantes, on peut constater l'état réfractaire des animaux immunisés. Ces faits démontrent péremptoirement qu'il n'est point besoin d'attendre quinze jours, ni même huit jours pour obtenir l'immunité, ainsi que certains auteurs l'avaient pensé.

Ajoutons que l'immunité que nous avons ainsi conférée à des cobayes est très persistante; au bout de trois mois et même au bout de six mois nous avons soumis des cobayes vaccinés à un nouveau contrôle par des doses considérables de vibrio virulent ; ils ont parfaitement résisté.

Jusqu'ici les résultats positifs ont été très nets ; mais en poursuivant l'extraction des bases par la méthode de M. Gautier, nous sommes arrivé à des constatations négatives, dont Timportance ne saurait être méconnue. Nous avons repris en

plusieurs temps notre résidu par Talcool absolu en triturant avec soin le magma produit par ralcool; nous avons fait quelques recherches avec cet extrait alcoolique après avoir chassé Talcool par évaporation. D'autre part nous avons continué l'extraction des bases en traitant par un mélange de deux parties de craie avec une partie de chaux éteinte ; il se dégage ainsi de Tammoniaque. Nous avons ensuite repris ce magma par Falcool à 85*" bouillant, puis filtré ; dans ce filtrat nous avons précipité la chaux par Tacide oxalique, et après nouvelle filtration nous avons neutralisé ce filtrat alcoolique par une ou deux gouttes d'acide chlorhydrique pur. Après évaporation de Talcool, on doit obtenir les chlorhydrates des bases, que Ton purifie par le traitement avec le bichlorure de mercure et l'hydrogène sulfuré.

Sans entrer dans le détail fastidieux des nombreuses tentatives de vaccination que nous avons faites, qu'il nous suffise de dire qu'aucun des animaux n'a été vacciné par nos extraits alcooliques. Tous les animaux sont morts, parfois avec un léger retard sur le témoin ; fréquemment l'ensemencement du sang nous a fait constater un nombre moindre de colonies; c'est à peine si un cobaye sur dix environ a survécu. Et cependant nous avons eu soin de soumettre certains animaux pendant longtemps à l'injection de ces substances ; nous avons pratiqué jusqu'à 7 injections au même cobaye, attendu quinze jours avant de les contrôler : nous avons toujours obtenu les mêmes résultats négatifs.

11 convient d'ajouter que nous avons complété nos recherches en faisant des essais avec les parties non solubles dans l'alcool; jamais nous n'avons réussi à vacciner un cobaye.

Nous sommes donc obligé de conclure que ralcool aUèrCy décompose y détruit la substance vaccinale.

Pour vérifier l'action de l'alcool sur le vaccin, nous avons procédé encore d'une façon différente. Une culture abondante de vibrio dans le bouillon de pieds de veau est évaporée à siccité ; ce résidu sec vaccine parfaitement. Une partie de ce résidu sec est traitée par l'alcool absolu légèrement acidulé par l'acide chlorhydrique, l'autre partie est traitée par l'alcool à 73*". L'alcool absolu ne dissout qu'une

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faible partie de ce résidu; ralcool étendu en dissout, au contraire, la majeure partie. Nous avons cherché à purifier, jusqu'à un certain point, ces produits par des précipitations successives par l'alcool absolu et des redissolutions par l'alcool étendu. Or niFim ni H autre de ces extraits alcooliques ne vaccine.

Voici d'ailleurs le bilan de nos expériences, faites en variant le nombre d'injections et en restant autant que possible au-dessous de la dose toxique (car il nousestarrivéde temps en temps de perdre un animal par intoxication). Sur sept cobayes traités par l'extrait alcoolique à TS'^un seul a résisté à l'infection, un est mort intoxiqué, cinq sont morts d'infection vibrionienne, parfois avec un léger retard sur le témoin. D'autre part, de sept cobayes traités avec les substances solubles dans Talcool absolu acidulé, six sont morts de septicémie vibrionienne, un seul a survécu après avoir, toutefois, présenté le tableau complet de la maladie.

Ajoutons que nous avons mis à part le résidu insoluble dans l'alcool, et que plusieurs expériences nous permettent d'affirmer que ce résidu ne possède aucun pouvoir immunisant.

Ces résultats, quoique négatifs, n'en sont pas moins instructifs; ils montrent avant tout que l'alcool est loin d'être toujours im réactif inoffensif pour les substances vaccinales. Ce point mérite d'être mis en relief, car dans nombre de recherches sur les toxines et les vaccins chimiques, c'est la précipitation par l'alcool qui a été le premier temps des manipulations. Dans notre cas particulier, force est de reconnaître que l'alcool annihile ou atténue dans une très large mesure la propriété vaccinale de nos produits; car ni les substances solubles dans l'alcool, ni les substances qui y sont insolubles ne vaccinent après l'intervention de ce réactif.

Il faut donc user avec précaution de ce réactif dans les recherches sur les produits bactériens. Si dans notre cas il a détruit le vaccin, ne sait-on pas que dans d'autres cas, comme l'ont montré par exemple les recherches de MM. Bouveret et Devic ^ sur la tétanie d'origine gastrique, l'alcool est capable

i . Revue de médecine, 1892. V. aussi OxMiiLâA. Les poisons bactériens in Bibliothèque médicale Charcot-DeboTO (1892)«

ARCH. OB MBD. EZPBR. ~> TOMB V. 4

de déterminer la formation de produits vraisemblablement alcaloïdiques et d'une extrême toxicité?

Poursuivant notre but et cherchant à nous rapprocher le plus possible de la substance vaccinale, nous nous sommes adressé à une méthode où Talcool n'intervient à aucun moment. Nous avons eu recours à la précipitation par le sulfate d'ammoniaque.

Voici la technique que nous avons suivie. Après avoir fait évaporer à siccité un litre environ d'une culture de vibrio dans le bouillon de pieds de veau, nous avons repris le résidu par une solution de chlorure de sodium au dixième, préala-blement filtrée, puis stérilisée à Tautoclave. Cette opération a été faite plusieurs fois, laissant Textraction des produits se faire lentement pendant vingt-quatre heures. On obtient ainsi un liquide trouble, filtrant très difficilement sur le papier et donnant un filtrat trouble. Pour remédier à ce petit inconvénient nous avons clarifié par le blanc d'oeuf et nous avons eu soin de nous assurer que cette opération ne détruit pas le pouvoir vaccinant.

Puis' nous avons ajouté à ce liquide du sulfate d'ammoniaque en excès, qui y détermine un abondant précipité ; par la filtration nous avons séparé ce précipité floconneux, blanc grisâtre, réservant le liquide filtré pour des recherches ultérieures. Le précipité est redissous par l'eau salée, reprécipité par le sulfate d'ammoniaque deux ou trois fois, de manière à avoir un produit aussi pur que possible, enfin soumis à la dialyse, de manière à nous débarrasser, sinon de là totalité, du moins de la majeure partie du sulfate d'ammoniaque. Ce qui reste sur le dialyseur est redissous dans l'eau salée, puis filtré. Remarquons que cette substance est insoluble dans le carbonate de soude.

Le liquide ainsi obtenu ne donne de précipité ni par l'ébullition, ni par les acides minéraux, ni par l'acide acétique. L'alcool y détermine par contre un abondant précipité, ainsi que le ferrocyanure de potassium et l'acide acétique à chaud ;

COHTRIBUTION A l'ÉTUDE DU VIBRION AVICIDE. 51

la réaction xantho-protéique et celle du biuret sont très nettes.

Nous sommes ainsi arrivé à extraire de notre culture un corps qui présente un certain nombre des réactions qui servent à caractériser les albuminoïdes.

D'autre part, ainsi que nous Tavons dit, nous avions gartié les parties qui sont solubles dans le sulfate d'ammoniaque en excès. Après avoir concentré ce liquide par évaporation, nous avons séparé Tacide sulfurique par un lait de baryte et chassé l'excès de baryte par un courant d'acide carbonique, puis nous avons évaporé ce produit à consistance sirupeuse, ce qui nous a permis de chasser l'ammoniaque.

Nous étions ainsi en possession de deux produits, l'un renfermant les principes non précipitables par le sulfate d'ammoniaque en excès, l'autre contenant les substances précipitées par ce réactif.

Le premier de ces produits nous a paru très toxique ; deux des cobayes en expérience sont morts empoisonnés; aucun de ceux que nous avons cherché à vacciner n'a résisté à l'infection vibnonienne.

Par contre, nous avons presque constamment réussi à vacciner les cobayes par les substances précipitables par le sulfate d'ammoniaque. Mais cette action vaccinante est moins prompte à se manifester et, pour obtenir une vaccination solide, il est bon de faire trois injections à des intervalles de deux jours. Il faut d'ailleurs reconnaître que la vaccination est moins sûre qu'avec l'extrait que nous avons préparé après précipitation par l'acétate de plomb ; nous avons même eu à enregistrer quelques insuccès.

Il existe néanmoins, d'une façon incontestable, un produit qui possède un certain nombre de réactions des substances albuminoïdes et qui vaccine. Ces propriétés ne dépendent pas du milieu de culture, car nous avons cultivé le vibrio dans un bouillon qui ne renferme pas d'albuminoïdes et dont voici la composition :

Eau iOOO gr.

Glycérine 40 —

Sel marin •• 5 —

Extrait de Liebig. . • 5 —

Dans ce milieu la culture est moins abondante; mais après évaporation et sursaturation par le sulfate d'ammoniaque, on trouve que le précipité ainsi obtenu vaccine encore fort bien.

Si nous résumons ces recherches sur les substances vaccinantes du vibrion avicide, nous devons d'abord constater que nous ne sommes pas arrivé à isoler le vaccin. Néanmoins, grâce au contrôle expérimental après chaque nouvelle intervention d'un corps chimique, nous avons pu le suivre aussi loin que possible et nous avons trouvé ce fait intéressant que l'alcool détruit la substance vaccinale.

D'un autre côté, il résulte de nos recherches qu'il existe vraisemblablement plusieurs substances vaccinantes, qu'il serait téméraire de ranger dans tel ou tel groupe bien défini ; il vaut mieux, dans l'état actuel des choses, se borner à les caractériser par leurs réactions ; il y a une substance qui n'est pas précipitée par l'acétate de plomb ; il y a une substance qui , précipitée par le sulfate d'ammoniaque, présente un grand nombre de réactions des albuminoïdes ; il existe, en outre, ime substance volatile (Gamaleïa et Hemandez').

Il nous a également paru intéressant d'étudier l'action physiologique des poisons du vibrio avicide, en envisageant la question à un point de vue tout différent de celui qui a guidé les recherches de M. Wolkow*. Nous avons procédé, comme l'a fait M. Gamaleïa dans l'étude de différents poisons bactériens (diphtérie, choléra), en cherchant à dissocier les effets des poisons par le chauffage.

On tend à admettre actuellement que le poison primitif, celui qui est capable de reproduire chez l'animal la plupart des symptômes de la maladie même, est un poison peu résistant, qui se détruit ou se décompose à une température supérieure à 60*. D'autre part, on admet l'existence d'un poison secondaire supportant les températures élevées. (100* à 120»)