TECHNIQUE
Avant de commencer l'étude des espèces, quelques mots sur la technique employée sont nécessaires.
Le sang a été recueilli au cœur au moyen de pipettes de verre finement effilées. Après avoir soulevé l'opercule, on pique le cœur, facile aviser, lorsqu'on s'est fixé des points de repère. C'est un procédé excellent qui peut être employé avantageusement pour l'examen du sang des animaux en cours d'expérience. Cette opération, conduite avec précision à l'aide d'une canule suffisamment fine, n'entraîne pas la mort du Poisson et peut même être renouvelée plusieurs fois.
Le nombre des Trypanosomes est en général très faible et, comme on le verra dans la suite, la proportion des Poissons infestés n'est pas très élevée. Il s'agit presque toujours d'infections chroniques,
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OÙ l'on ne trouve dans une forte épaisseur de sang entre lame et lamelle que de très rares parasites.
Dans ces cas, pour en constater Texistence il est avantageux de centrifuger pendant 10 minutes un mélange de sang provenant de plusieurs animaux de même espèce, dilué dans une petite quantité de solution citratée (eau 1000, chlorure de sodium 5, citrate de soude 5). En aspirant avec une pipette la portion du culot qui surmonte les globules rouges, on recueille quelques gouttes d'un liquide tenant en suspension des globules blancs déformés, et des Trypanosomes, quand il en existe.
Mais en présence d'un résultat positif, Texamen isolé de chacun des Poissons par la méthode des frottis permet seul d'établir une statistique exacte.
L'examen prolongé des parasites vivants a été fait entre lame et lamelle. Il importe d'éviter la contamination de la préparation par les Bactéries. Il faut pour cela recueillir le sang purement, opérer vite etaseptiquement et le déposer entre lame et lamelle flambées. Le bord de la lamelle est luté ensuite par une bordure de paraffine.
L'observation des Trypanosomes est alors possible pendant longtemps, et l'on assiste parfois à des phases très curieuses de multiplication et de mutation de formes.
L'examen après coloration, qui permet seul de prendre connaissance de la morphologie de ces Flagellés, a été effectué à l'aide de la méthode préconisée par Laveran (1900), et de la méthode de Giemsa. Les lames recouvertes d'une mince couche de sang étaient séchées rapidement et plongées pendant dix minutes, pour la fixation, dans l'alcool absolu. Le mélange de bleu-éosine était alors déposé sur lame après évaporation de l'alcool.
Une première difficulté de la coloration (dans l'emploi du bleu Borrel-éosine) réside dans la composition du bain.
Les proportions de matières colorantes ne se trouvent que par tâtonnements, en partant de solutions titrées, toujours les mômes, et malgré cette précaution, on n'échappe pas à une cause d'insuccès due aux modifications qui se produisent dans la solution de bleu à l'oxyde d'argent en vieillissant. Un deuxième inconvénient, inhérent à la méthode elle-même, provient de la formation de précipité qui est parfois très abondant, et peut donner lieu à de fausses in-
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terprétations. On s*en débarrasse, lorsqu'il n'est pas trop envahissant, par lavage de la lame sous un fort courant d'eau, ou bien, après séchage par un lavage au xylol, en traînant à la surface de la couche sanguine, une linge fin trempé dans le dissolvant, comme l'indique Laveran.
Malgré la protection efficace que fournit aux parasites la laque sanguine qui les emprisonne, ils peuvent dans certains cas souflrir de la rudesse de ces traitements.
La coloration dans une boîte de Pétri ou dans une cuve ad hoc, permettant de maintenir en bas la face de la lame recouverte de sang, donne de meilleurs résultats, mais cette méthode a l'inconvénient de nécessiter l'emploi d'une plus grande quantité de mélange qui précipite entièrement au bout de peu de temps.
J'ai souvent employé l'artifice suivant, et j'en ai obtenu de bons résultats. Il consiste à faire adhérer le précipité à des feuilles de papier absorbant fin, de papier à cigarettes par exemple. On en découpe des bandes de dimensions un peu plus faibles que celles de la lame ; on dépose une de ces bandes sur la couche sanguine, et l'on verse par-dessus, à l'aide d'un compte-gouttes, le mélange colorant. Le précipité reste fixé au papier et la coloration peut être prolongée très longtemps selon le besoin. On peut aussi se contenter, après avoir versé quelques gouttes de colorant sur la lame, de laisser flotter la feuille à la surface du liquide, la plus grande partie du précipité lui adhère. Le lavage final entraîne le papier et l'excès de colorant, on peut l'effectuer avec beaucoup de douceur.
La méthode de Giemsa, à l'aide de la solution toute préparée de Grûbler, n'exige pas tant de précautions, elle ne donne en effet que très peu de précipité, et à part les tâtonnements pour arriver à la bonne dilution du colorant, elle est d'un emploi beaucoup plus facile. Mais il m'a semblé qu'elle ne permettait pas une coloration élective aussi délicate des Trypanosomes.
Après lavage rapide à l'eau les lames étaient traitées par le tanin à 3 pour 100 ou la solution de tanin-orange de Unna etséchées rapidement.
J'ai employé aussi la méthode de Heidenhain qui permet de suivre le flagelle dans les cas difficiles, mais donne de moins bons résultats que le mélange bleu-éosiné dans l'étude des parasites. Il est facile de se rendre compte que les insuccès proviennent de la pré-
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sence de cette laque sanguinç qui prend la coloration et gène Tobservation des éléments sous-jacents. 11 faut pour réussir opérer sur des parasites obtenus par centrifugation et débarrassés de sang aussi totalement que possible.
Voici la liste des Téléostéens marins examinés indiquant d'une part les espèces parasitées, et d'autre part celles qui ont été trouvées indemnes. Le chiffre se rapporte au nombre d'individus étudiés (1). Ces Poissons provenaient des eaux de Luc-sur-Mer.
I. — L'existence de Trypanosomes a été constatée chez 10 Soka vulgaris (Quens.), 30 Platessa vulgaris (Flem.), 25 Callionymus lyra (Lin.), 8 CotUis bubalis (Euphrasen), 8 Gobius niger (Lin.), 3 Blennim pholis (Lin.), 15 Limanda platessoïdes (Faber), 20 Platophrys latema (Walb.), très nombreuses Angtiilla viilgarv; (Turi,), 3 Botkus rhombus (Lin.), 9 Pletironectes flesus (Lin.).
IL — L'existence des Trypanosomes n*a pas été constatée chez 4 Nerophis lumbricoides, 4 Hippocampus guttulatus, 9 Syngnathus, 10 Motella tricirrata, 9 Motella musteldy nombreux Gadus luscus (centrifugation), 6 Mullus surmulettus, très nombreux Conger conger (centrifugation), 20 Gunellus vulgaris, très nombreux Scomber scomber (centrifugation), 6 Trachinus tipera, très nombreux Labrus (centrifugation), 8 Rhombus maximus, nombreuses Àlosa vulgaris (centrifugation), 6 Labrajc lupus, 8 Zeus faber,
DESCRIPTION DES TRYPANOSOMES
Trypanosoma soleœ (2) Laveran et Mesnil, 1901.
(( Nous n avons trouvé cet Hématozoaire qu'une fois sur quatre Soles(So/ea tulgaris) pêchées dans l'Anse Saint-Martin, près du Cap de la Hague (Manche); chez la Sole infectée, les parasites étaient extrêmement rares elle renfermait en plus des Hœmogregarina Simondi.
(( A Roscoff , l'existence des Trypanosomes de la Sole a été constatée par nous, mais dans une proportion plus faible encore que dans l'anse Saint-Martin. Dans le sang frais, T. sotea? présente l'aspect caractéristique des Trypanosomes. Les mouvements sont très vifs,
•(I) J'ai eu l'occasion d'examiner le sang d'un Esturgeon {Acipenser sturio) ; il ne renfermait pas d'Hématozoaires.
'tt) Cette description est colle donnée par Laveran et Mesnil dans leur ouvrage Trypanosomes et Trypanosotniases, 4904.
Archives de Parasitologie, X, n» 3, 1906. 23
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OU distingue une membrane ondulante et un flagelle à Textrémité antérieure. Sur les préparations colorées on peut constater les par ticularités suivantes : le parasite mesure 40 a de long, dont 32 environ pour le corps et 8 seulement pour le flagelle, qui comme on voit est très court. L'extrémité antérieure est souvent moins eflilée que la postérieure; vers la partie moyenne du corps se trouve un noyau ovalaire contenant de grosses granulations de chromatine; le centrosome, situé vers l'extrémité postérieure, est sphérique et notablement plus gros que chez T. Remaki, La membrane ondulante est bien développée. Le flagelle part du centrosome, borde la membrane ondulante et présente une courte partie libre en avant du corps. Le protoplasma renferme quelques granules chromatiques vers l'extrémité postérieure, et montre quelques fines stries longitudinales. »
J'ai retrouvé à Luc, chez Solea rulgaris, le Trypanosome décrit par Laveran et Mesnil avec la môme fréquence, mais avec des dimensions un peu plus fortes pour le corps (pi. VII, fig. 3) : 33 jx, et moindres pour la partie libre du flagelle. Sur les Trypanosomes bien étalés, elle ne mesurait le plus souvent que 4 à 5 jjl. Le blépharoplaste est distant de l'extrémité postérieure.
Trypanosoma platessae Lebailly, 1904 (pi. VII, fig. 10).
On rencontre ce Trypanosome une fois sur six environ; cette moyenne est tirée de l'examen de 30 Plies (Platessa vulgark Flem.). A l'état frais, il présente des mouvements assez rapides au début, puis il se ralentit et devient plus facile à observer. On remarque que ses mouvements de translation sont très faibles, il ne disparait que lentement du champ du microscope. Au contraire, sur place il se contourne de différentes manières, tantôt en 8 de chiffre, et alors le point de croisement prend une réfringence spéciale très frappante; ou bien il s'enroule en crosse ou en spirale, et la membrane ondulante qui occupe la grande courbure est le siège d'une ondulation qui se transmet d'une extrémité à l'autre et change parfois de sens.
Cet Hématozoaire est en général peu abondant, dans une goutte de sang entre lame et lamelle on ne rencontre dans les cas d'infection chronique que deux ou trois individus. Une des Plies en contenait cependant davantage.
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Conservés en préparation lutée à la parafline, les parasites ont succombé en peu de temps à la température du laboratoire (24<>). Puisés dans le sang du cœur d'une Plie vivante à dix heures du matin, ils étaient trouvés immobiles à cinq heures du soir.
Après coloration on reconnaît les dimensions suivantes : longueur totale 42a; dont 32 pour le corps et 10 pour le flagelle; largeur : 3 à 4 ,a; blépharoplaste situé à 3 u de l'extrémité postérieure. Le corps protoplasmique se colore en bleu, sauf aux extrémités, qui restent claires. Il renferme des granulations qui ne prennent pas très fortement la couleur. On voit de place en place des espaces plus clairs qui sont des sortes de vacuoles à contour irrégulier.
Le noyau situé à l'union des tiers moyen et antérieur est arrondi. Le blépharoplaste est très gros et prend fortement la couleur, en arrière de lui, l'extrémité protoplasmique terminale est pointue et retroussée. Elle est assez fragile et manque souvent sur les préparations colorées. Le Trypanosome paraît alors se terminer brusquement au blépharoplaste; il est aisé de reconnaître que cette mutilation s*est produite pendant le frottis. Du blépharoplaste part un flagelle qui borde la membrane ondulante et devient libre à l'extrémité antérieure sur une longueur de 10 [i.
Le sang de ces Plies renfermait en môme temps des Hémogrégarines.Les Poissons parasités, conservésen aquarium, n'ont pasprésenté des rechutes avec multiplication des parasites. Leur sang examiné à plusieurs reprises montrait toujours des Trypanosomes peu nombreux.
Trypanosoma flesi Lebailly, 1904 (pi. VII, fig. 7).
Il se rencontre chez Pletiroîiectes flesus (Lin.) une fois sur cinq environ. Il ressemble h l'état frais au T, platessœ avec des mouvements lents de torsion et d'enroulement sans déplacement important dans le champ du microscope. Au bout d'une heure, ses mouvements se sont tellement ralentis, que l'observation en devient facile; on distingue bien la membrane ondulante, le flagelle, et le noyau qui se présente souvent sous la forme de deux disques concentriques, dont le plus petit est de couleur sombre.
Dans les préparations de sang frais lutées à la parafline, il meurt plus vite que T, platessœ. Il mesure 47 |x de long; 38 pour le corps et 9 pour le flagelle, largeur maxima : 4 jjl. Le corps protoplas-
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mique se colore assez fortement en bleu, mais montre surtout des granulations nombreuses, assez grosses, remarquables par leur coloration intense.
La grande majorité des Trypanosomes observés présentait ce caractère granuleux alors que c'était le contraire chez T, platessœ, où le cytoplasme est plus uniformément bleu pâle. Il existe des individus de dimensions plus faibles (35 h^). Le blépharoplaste est gros et se colore fortement. Il est distant de 3 p. 5 de la pointe protoplasmique postérieure. Le flagelle part du blépharoplaste, borde la membrane ondulante qui est peu plissée et devient libre en avant, sur une longueur de 9 \l. Le noyau, arrondi régulièment, mesure 3 |t de diamètre. Il est situé vers le milieu du corps plus rapproché cependant de l'extrémité antérieure. Ce Trypanosome coexistait avec les Hémogrégarines.
Trypanosoma limandœ Brumpt et Lebailly, 1904 (pi. VII, fig. H).
Les Limandes (Limandu platessoides Faber) de la région de Luc sont peu infestées en comparaison des autres Pleronectes pochés aux mêmes endroits. Une seule sur 15 examinées avait dans le sang un Trypanosome, à l'exclusion de tout autre parasite, et je n'ai jamais rencontré d'Hématozoaires endoglobulaires chez cette espèce. C'est la seule exception à ce fait général que les Poissons marins osseux renferment à la fois dans leur sang, ainsi que je l'ai montré, des Trypanosomes et des Hémogrégarines.
Le parasite dont il s'agit ici est bien différent, morphologiquement de ceux que nous venons d'étudier et il n'a de rapport qu'avec celui de la Blennie, qui sera décrit plus loin.
L'une des premières Limandes examinées au mois d'août 1904, avait dans le sang un Trypanosome assez abondant que j'ai recherché la môme année, et l'année suivante chez 15 Poissons, sans pouvoir le retrouver. Dans le sang frais il est très mobile; mais à rinverse de presque tous les autres Trypanosomes des Téléostéens, il progresse rapidement dans la goutte de sang, quitte le champ d'observation avec rapidité, ou le traverse souvent comme une flèche, jusqu'au moment où l'état de coagulation du sang, et le ralentissement des mouvements l'immobilisent. Il paraît vivre assez longtemps entre lame et lamelle, mais l'observation n'a pas été prolongée par suite de l'envahissement de la préparation par les Bactéries,
Ses dimensions sont les suivantes : longueur totale 32 à 38 fx; longueur du corps : 23 |x, partie libre du flagelle : 15 fx; largeur 2 à 2 fA 5. Le cytoplasme se colore faiblement en bleu et ne renferme que peu de granulations.
Le noyau est quatre fois plus long que large, en rapport avec le faible diamètre du corps protoplasmique.
11 est situé à l'union des tiers moyen et postérieur et par suite i^pproché du blépharoplaste. Celui-ci est une masse chromatique mportante, presque aussi grosse que'chez T. platessœ et T, flesi et sa taille est rendue d'autant plus frappante que les autres dimensions du parasite sont bien inférieures. Le flagelle part du blépharoplaste, borde la membrane ondulante peu plissée et faiblement colorée et devient libre sur une grande longueur. Il existait, dans le sang de cette Limande des individus de taille variable, mais dans des limites assez faibles. On ne rencontrait pas de formes de division.
Trypanosoma laternœ Lebailly, 1904 (pi. VII, fig. 6).
On trouve chez la moitiédes Platophrys /aierna(Walb.) des parasites endoglobulaires parfois en assez grand nombre, mais il est beaucoup plus rare de rencontrer des Trypanosomes. Dans Texamen de 20 de ces Poissons, je n'en ai vu qu'une fois. Leur recherche ne doit pas se faire dans le sang frais, mais seulement après coloration à cause d'une particularité qu'il faut bien connaître.' Ces petits Pieuronectes meurent très rapidement, même lorsqu'on les maintient dans de bonnes conditions après leur capture au chalut. Les Trypanosomes qu'ils renferment subissent le même sort peu de temps après leur hôte, et bien que leur taille soit grande, la perte de la mobilité les rend difficiles à déceler. Ce Trypanosome n'a pas été étudié vivant, mais on peut présumer d'après sa ressemblance avec celui de la Sole et de quelques autres Poissons, qu'il accomplit des évolutions sur place et ne présente que de faibles mouvements de translation.
Ses dimensions sont les suivantes : longueur totale 55 f/, longueur du corps44 fx, portion libre du flagelle 11 /x; largeur 4 à 5/x. Le cytoplasme est fortement granuleux et se colore d'une manière intense en bleu, sauf dans la partie tout à fait postérieure. Les granulations sont très nombreuses au voisinage du noyau et quelquesunes absorbent le colorant avec intensité.
