OPÉRATIONS EFFECTUÉES PAR LES ÉLÈVES
Au cours des manipulations de parasitologie, les élèves de l'Institut de Médecine coloniale reçoivent une série de coupes qui représentent les lésions produites par les principaux parasites. Ces coupes permettent à chaque élève de se constituer une collection de préparations-types.
Les coupes distribuées doivent être co//m sur lames, puis colorées et enfin montées par les élèves. Eludions donc successivement le collage des coupes, leur traitement avant coloration, la coloration et le montage.
Collage des coupes A la paraffine.
Iniimmeiits : 1 scalpel, 2 aiguilles droites à dissocier, 1 compte-gouttes,
lames perte-objet dans un bocal à demi plein d'alcool à 90*. Réactifs : Albumioe de Mayer, eau distillée.
1<> détacher du ruban une ou deux coupes avec un scalpel et les déposer sur une lame porte-objet bien propre, en ayant soin de mettre le côté brillant des coupes en dessous.
2^ avec le compte-gouttes introduire sotis les coupes une solution étendue d'albumine (20 gouttes d'albumine de Mayer (1) pour 50 ce. d'eau distillée), de façon à les faire flotter.
S*" chauffer le porte-objet avec précaution sur une flamme ou mieux sur une plaque métallique chauffée. Les coupes s'étalent d'elles-mêmes sous Tinfluence de la chaleur.
Remarques. — a. — Quand les coupes sont fortement plissées, il
(1) Four faire l'albumine de Mayer, on prend poids égaux de blanc d*œuf et de glycérine, on les agite bien ensemble et on filtre. Cette flltration est très lente. On ajoute au liquide filtré un cristal de camphre ou de thymol, pour en assurer la ooBservaUoD.
faut, avant de ks chauffer, et après les avoir fait flotter sur Veau albumineuse, les déplisser une à une avec les aiguilles.
b. — // faut avoir bien soin de ne pas chauffer jusqu'à fusion de la paraffine, car les coupes seraient irrémédiablement détériorées,
i^ Quand les coupes sont bien étalées, égoutter l'excès de liquide.
5" Disposer la coupe au milieu de la lame avec les aiguilles.
6^ Essuyer le porte-objet autour de la coupe avec un chiffon non pelucheux.
7^ Laissez sécher 12 heures dans un tiroir, à Tabri de la poussière ou seulement deux heures dans une étuve chau0ée à + 35"* .
Traitement des lames portant les coupes collées A ralbumine.
De même que le collage des coupes, le traitement des lames est un procédé général qui doit toujours précéder la coloration, de quelque nature que soit cette dernière. Toutes les coupes distribuées devront donc subir ce traitement avant d'être colorées soit à rhématéine, soit au Gram, etc.
1<> Lorsque les coupes collées sont complètement sèches, chauffer légèrement le porte-objet de façon à faire fondre la paraffine et à coaguler l'albumine.
Remarques. — a. — Cette opération est indispensable, car les coupes ne sont définitivement collées qu'après la coagulation de l'albumine.
b. — // ne faut pas trop chauffer, sous peine d'altérer irrémédiai}lement les coupes. Il faut donc éloigner le porte-objet de la flamme, dès que la parafine est fondue.
29 Plonger la lame dans un premier tube de xylol pendant une minute.
3^ Transporter la lame dans un second tube de xylol pour éliminer le premier liquide, souillé de paraffine.
4** Laver dans un premier alcool à OO*'.
5** Enlever toute trace de xylol dans un second alcool.
6** Laver à fond dans de l'eau propre.
Les coupes sont alors prêtes à subir une coloration quelconque. Si on ne peut procéder de suite à cette coloration, il faut laisser la lame dans l'eau ou dans l'alcool. Si on la laissait sécher, Tes coupes seraient irrémédiablement perdues.
Coloration A rhématéine-éoslne
Réactifs: Hématéine acide, solution aqueuse d'éosine.à un pour 1000, alcool à 90*, alcool absolu, xyloi.
i"" Sortir la lame de Teau et la plonger pendant une à cinq minutes dans une solution acide d'hématéine (hémalun de Mayer ou hématéine acide d*EhrIich(l).
2^ Rincer à Teau et regarder au microscope, avec lobjectif 2, si les noyaux sont suffisamment colorés.
3** Quand la coloration est suffisante, c'est-à-dire lorsque les noyaux ont pris une belle teinte violette, rincer à fond pour enlever l'excès de colorant.
4" Ftra^c — Laisser les coupes dans de l'eau ordinaire propre, jusqu'à ceque la coloration rougeâtre des noyaux ait viré au bleu noir.
5"^ Plonger 30 secondes dans une solution d*éosine (éosine à l'eau à 1 pour 1000 dans l'eau distillée).
6'' LaveràreaupourenleverTexcèsde colorant, puisa l'alcool à 90'\
7° Déshydratation. — Verser à trois reprises sur les coupes de Talcool absolu conservé dans un flacon bien bouché. Balancer la lame pour que les coupes soient bien pénélrées'par le liquide.
8"* Éclaircir dans un tube de xylol propre, où la lame séjourne pendant qu'on prépare une lamelle. Le xylol ne doit pas se troubler, sinon il faut recommencer la déshydratation.
9** Montage des coupes. — Essuyer rapidement autour des coupes Texcès de xylol, déposer une goutte de baume au milieu de la préparation et couvrir avec la lamelle. Appuyer légèrement pour chasser les bulles d'air et absorber au besoin l'excès de baume avec du papier buvard.
Remarque. — Veiller attentivement à ce que les lames portant les coupes soient toujours dans un liquide et ne sèclient pas entre deux opérations.
(1) Hématéine acide d'Ehrlich:
Eau disUllée 100 ce.
Alcool à 90' 100 ce.
Glycérine 100 ce.
Acide acétique eristallisable 10 ce.
Hématéine gr. 5
Alun 80 gr.
Coloration du tissu conjonotif (méthode de Curtis).
Pour étudier les scléroses produites par Taction des parasites, dans divers organes, et notamment dans la glande hépatique, il est nécessaire d'employer une coloration qui mette en évidence le tissu conjonctif.
La méthode la plus simple est celle de Curtis (1). Elle nécessiteles opérations suivantes :
1* Après avoir débarrassé les coupes de la paraffine, suivant la méthode habituelle, les colorer 24 heures, dans un tube Borrel, par la safranine anilinée (parties égales de solution alcoolique saturée de safranine et d'eau anilinée à saturation). On colore ainsi les noyaux. Si on est pressé, une heure de coloration peut suffire.
2* Bien rincer à Teau pour enlever Texcès du colorant.
3° Bien égoutter Texcès d'eau.
40 Verser sur la lame un mélange de 9 parties d'eau distillée saturée d'acide picrique et dei partie de la solution suivante:
Eau distillée 80 gr.
Glycérine 20 gr.
Noir naphtol B 1 gr.
Laisser agir trois minutes.
o^ Sans laver à l'eau, différencier par l'alcool absolu, jusqu'à ce qu'il ne s'échappe plus de couleur rouge et que les parties sclérosées ressortent en bleu sur le fond jaune de la préparation.
6° Arrêter la différenciation en lavant au xylol.
70 Monter au baume.
Dans une préparation réussie, les noyaux sont rouges, le protoplasma jaune, le tissu conjonctif bleu.
Coloration au Gram-Ligniéres.
Réactifs ; Violet de gentiane phéniqué, solution de Lugol forte, solution de Lignières.
Cette coloration est destinée à l'étude du Discomyces bom \actinomycose) dans les frottis et dans les coupes. C'est une modification de la méthode de Gram.
(i) F. Curtis, Mélhode de coloration élecUvedu Ussu conjonctif. C. jR. Soc. biol-t LVIII, p. 1038-1040» 1905.
!• Coller les coupes et l?s débarrasser delà paraffine, comme pour les autres colorations.
2° Colorer les noyaux dans la solution d'hématéine et virer à Teau, comme il a été dit.
3"" Colorer au violet de gentiane phéniqué pendant 3 minutes. On peut chauffer quelques secondes, jusqu'à production de vapeurs, puis achever la coloration à froid.
4<> Enlever rapidement dans Teau l'excès de colorant.
5'' Faire agir la solution de Lugol pendant une minute.
6* Sans laver à Teau, décolorer rapidement avec la solution de Ligniëres(l), jusqu'à ce que la coupe prenne une coloration rouge vif et que les grains d'actinomycose restent seuls colorés en violet (surveiller au microscope).
T Différencier dans Teau propre, jusqu'à ce que les massues apparaissent en rouge sur un fond rose très clair.
8o Déshydrater par Talcool absolu, éclaircir au xylol et monter au baume.
Dans une préparation réussie, les noyaux sont colorés en violet clair, les filaments du Discumyces en violet foncé, les massues en rouge vif, le tissu conjonctif et le protoplasma des cellules en rose.
