FROTTIS
l"" Frottis de cultures. — Prendre une trace de culture avec le fil flambé et retendre en couche mince au centre de la lame.
2' Frottis de crachats. — La recherche des Bacilles dans les crachats nummulaires et franchement purulents ne présente pas de difficultés ; quand on n'a que des crachats muqueux ou sanguinolents, il faut recourir à Thomogénéisation.
a. — Crachats nummulaires. — Prélever un grumeau jaunâtre au centre de la masse purulente et Tétaler suivant le procédé ordinaire.
b. — Homogénéisation des crachats. — Par le procédé de Jousset (inoscopie) :
1. — Traiter les crachats pendant deux à trois heures à l'étuve à SS"", par le suc gastrique artificiel de Jousset : les crachats sont liquéfiés et transformés en une sorte d'émulsion. Les Bacilles tombent à la partie inférieure.
2. — Prélever au fond du tube une petite portion du dépôt et l'étaler sur la lame avec une pipette.
COLORAÎION PAR LA MÉTHODE DE ZIËHL.
Principe de la coloration. — Le Bacille de la tuberculose se colore difficilement par les couleurs basiques d'aniline : une fois coloré, il retient énergiquement la couleur, même quand on le soumet à un décolorant puissant. On colore donc le frottis par la fuchsine phéniquée à chaud : on décolore ensuite par une solution acide : les Bacilles de la tuberculose restent seuls colorés. On colore enfin le fond avec un colorant de contraste (bleu de méthylène).
Technique de la coloration. — 1"" Fixer le frottis en le passant trois fois, face en dessus, dans la flamme du bec Bunsen.
2^ Déposer sur le frottis une grosse goutte de fuchsine phéniquée de Ziehl.
3** ChauiTer doucement sur la veilleuse du bec Bunsen pendant deux minutes, sans faire bouillir. La préparation ne doit pas sécher.
4*» Jeter Texcès de fuchsine et verser rapidement sur la préparation quelques gouttes d'acide azotique au tiers, laisser en contact quelques secondes. Le frottis prend une teinte jaunâtre.
3^ Laver à grande eau : la préparation doit devenir rose pâle, sinon il faut recommencer la décoloration par Tacide azotique.
6« Compléter la décoloration en traitant la préparation par Talcool absolu jusqu'à ce qu*elle prenne une teinte très légèrement rosée.
7** Laver à Teau.
8^ Verser sur la préparation quelques gouttes de solution de bleu de méthylène, pour colorer le fond (hématies, leucocytes, etc). Laisser quelques secondes en contact.
9"" Laver à grande eau.
10*» Sécher au buvard.
11° Déposer sur la préparation une goutte d'huile de cèdre, recouvrir d'une lamelle et examiner avec l'objectif 8.
Résumé : Faire un frottis, fixer, colorer à la fuchsine, décolorer par Vacide azotique, laver, décolorer par Valcool absolu, laver, colorer le fond au bleu de méthylène, laver, sécher, examiner.
Dans une préparation réussie, les Bacilles de la tuberculose sont colorés en rouge, tandis que les autres Bactéries et le fond sont colorés en bleu.
Coloration du Bacille de la diphtérie.
La recherche du Bacille de la diphtérie comporte deux opérations: l'examen microscopique de frottis de fausses membranes et la culture de ces fausses membranes. Le diagnostic bactériologique peut ainsi être porté en 24 heures.
Frottis. — Ils sont faits, suivant la méthode habituelle, avec une parcelle de culture ou de fausse membrane.
Coloration par la méthode de Gram. — Le Bacille de la diphtérie se colore facilement par toutes les couleurs basiques d*aniline : il est préférable, pourle diagaostic différentiel, d^employer la méthode de Gram.
Principe de la méthode de Gram.
lo On colore les Bactéries par une couleur d*aniline basique en solution phéniquée.
2^ On fait agir sur les Bactéries unmordant à base diode (liquide de Lugol).
3» On traite la préparation par lalcool absolu. Certaines Bactéries se décolorent sous l'action de Talcool, on dit alors qu'elles ne prennent pas le Gram : tel est le cas du Bacille typhique. D'aulres Bactéries restent colorées après l'action de Talcool : on dit alors qu'elles prennent le Gram : tel est le cas des Bacilles de la diphtérie et du charbon.
Technique de la coloration.
i* Fixer le frotlis en le passant trois fois, face en dessus, dans la flamme du bec Bunsen.
2p Recouvrir le frottis avec une grosse goutte de violet phéniqué.
3«» Colorer une minute en chauffant légèrement.
4*» Rejeter la solution colorante.
50 Sans laver Veau, déposer sur le frottis une ou deux grosses gouttes du liquide de Lugol (iodure de potassium iodé). Laisser en contact une demi-minute. La préparation doit prendre une teinte brun-noirâtre.
6® Laver à l'eau et sécher au buvard.
1<^ Verser avec précaution de lalcool absolu sur la préparation. Ce temps constitue la décoloration : celle-ci doit être surveillée de très près et arrêtée dès que l'alcool n'enlève plus de nuages violets de la préparation. En effet la coloration du Bacille de la diphtérie ne résiste pas à l'action trop prolongée de l'alcool.
S*' Laver rapidement à l'eau.
9^ Colorer le fond de la préparation par une solution aqueuse d'éosine, pendant une minute.
10° Laver à grande eau, sécher au buvard et examiner dans l'huile de cèdre.
Résumé : Préparer un frottis, fixer, colorer au violet phéniqué, traiter par une solution iodo-iodurée, laver, sécher, décolorer par l'alcool, laver, colorer le fond par féosine, laver, sécher, examiner.
Dans une préparation réussie, les Bacilles ressorlent en violet foncé sur un fond rose.
Coloration du Gonocoque.
Pour faire le diagnostic microscopique de la blennorrhagie, il faut constater la présence des Gonocoques à l'intérieur des leucocytes et des cellules épithélialesdu pus : il faut aussi les distinguer des autres Diplocoques qui peuvent se rencontrer dans Texsudat. Cette distinction repose sur le fait que le Gonocoque ne prend pas le Gram.
Pour la simple recherche du Gonocoque, il suffit de colorer le frottis au bleu phéniqué ou même avec une simple solution aqueuse de bleu de méthylène. On réservera la méthode de Gram pour le diagnostic différentiel entre le Gonocoque et d'autres Diplocoques avec lesquels il pourrait être confondu.
Agglutination du Bacille typhique.
Principe. — Le séro-diagnostic de la fièvre typhoïde repose sur la propriété que possède le sérum des typhiques et des animaux immunisés d'agglutiner les Bacilles typhiques d'une culture en bouillon : ces Bacilles, épars et mobiles, perdent leur motilité et se groupent en petits amas.
Parmi les nombreuses méthodes qui ont été proposées, nous donnons la préférence à celle de Stassano (1). Sa technique, très simple et cependant très précise, permet de faire le séro-diagnos tic sans microscope.
Stassano remplace le sérum par le sang total laqué et produit l'agglutination dans une émulsion de Bacilles typhiques morts.
Instruments. — 1* Trois petits tubes à essai.
2* Deux pipettes égales, faites en étirant sur le bec Bunsen la partie moyenne d'un tube de verre long de 20 cent., dont les deux extrémités
(1) H. Stassano, Nccessalre clinique pour le séro-diagnosUc. C. R. Soc. biol.^ LXII, p. ÎS3, 1907. — Procédé simplifié de séro-diagnostic. Quinzaine thérapeutique, vu, p. 557-561, 1?07.
ont été bouchées avec de l'ouate. On coupe la partie effilée en son milieu et on obtient ainsi deux pipettes de calibre égal. L'une sert pour le sang l'autre pour la culture.
