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Quant au diamètre longitudinal et à l’espace qui sépare les grains les uns des autres, il semble à peu près égal dans les cultures sur milieu solide. Mais, dans le bouillon, où la prolifération est beaucoup plus rapide, les microbes sont rapprochés deux à deux d’une manière beaucoup plus accusée, de manière à former, pour ainsi dire, des chapelets de diplocoques.

Cette assertion n’est vraie que pendant les premiers jours. Dans les vieilles cultures, on trouve quelquefois des inégalités de diamètre; mais, surtout, on rencontre des grains qui ne se colorent que peu ou pas, à côté d’autres retenant vivement la matière colorante.

Ce sont ces grains, plus volumineux et peu colorables, qui ont été quelquefois décrits comme des spores, par analogie, sans doute, avec Le leuconostoc mesentoroïdes, dont les formes durables se différencient de cette manière au milieu des chaînettes.

Chez le streptocoque, on ne peut rien admettre de semblable. En effet, ces formes sont d'autant plus nombreuses que la culture est plus vieille, et elles sont à leur maximum lorsqu'il devient impossible d’en obtenir de nouveaux repiquages. Elles apparaissent chaque fois que le microbe se trouve dans de mauvaises conditions de nutrition, et les cultures qui les contiennent ont une vitalité plus fragile que celles qui en sont dépourvues. Enfin, au point de vue de leur aspect même, elles s’éloignent considérablement des spores. En effet, ces dernières apparaissent, en général, comme des points brillants très homogènes, alors que les formes que nous décrivons ont une réfringence moindre que ceux des autres grains de la chaïînette et une apparence légèrement granuleuse. Mème différence, en ce qui concerne leur appétence pour la matière colorante. Les spores se colorent difficilement et gardent fortement leur coloration. |

Les grains observés dans les vieilles cultures de streptocoques ne paraissent décolorés, que parce qu'ils cèdent

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facilement leur matière colorante aux substances employées pour enlever la surcoloration.

Rien donc n'autorise à comparer ces formes à des spores; tout, au contraire, semble démontrer que ce ne sont là que des formes d’involution, ou même des cadavres de streptocoques. Nous n'avons jamais pu, en effet, relever aucune apparence, aucun fait, qui puisse faire supposer que le streptocoque soit capable de produire des formes durables dans les conditions d'observation habituelles, et nous croyons que ce fait négatif est d’une grande importance, au point de vue de sa physiologie générale et de son rôle pathologique.

$ 2. — Alimentation du streptocoque.

Les conditions de développement du streptocoque sont faciles à réaliser. Au point de vue gazeux, en effet, il s’accommode facilement du contact de l'air, tout en se développant parfaitement dans un milieu privé d'oxygène. En effet, malgré certains auteurs, et, entre autres ceux de l’article du Dictionnaire de Dechambre, qui avaient besoin de sa nature aérobie pour l'édification de leurs théories, le streptocoque est un anaérobie facultatif. Nous irons même plus loin, en disant que le contact de l’air lui semble plus nuisible qu'utile.

Les cultures anaérobies sont, en effet, plus belles et se conservent plus longtemps que les cultures aérobies sur les mêmes milieux, et même, il nous a semblé que certains milieux (la peptone pure, par exemple, en solution à 2 p. 100) qui sembient réfractaires au contact de l’oxygène, peuvent fournir d'abondants développements, lorsque le vide a été fait au moyen d’une trompe puissante. Sur d’autres milieux, son développement s'accompagne, à l'abri de l'air, de phénomènes chimiques d'ordre diastasique, qui nese produisent point sur les cultures ordinaires,

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L'albumine coagulée du sérum est, en effet, liquéfiée dans le vide et transformée en peplone, sous l’action du streptocoque. Fidèle en cela aux lois établies par Pasteur, il se montre ferment d'autant plus actif, qu'il est davantage obligé d’arracher aux combinaisons qui l'entourent, l’oxygène dont il a besoin pour son existence. Il est donc plus anaérobie qu’aérobie. Ce n’est qu’un aérobie facultatif.

Au point de vue de son développement sur un milieu liquide ou solide, une condition prime toutes les autres : c'est celle de la réaction du milieu ensemencé. Sur les milieux acides, en effet, le développement est très faible ou même nul. Le streptocoque est à ce point de vue d’une sensibilité exquise, aussi, est-il préférable d’alcaliniser le milieu légèrement, ce qui ne produit aucun effet nuisible. Cette aversion pour les acides est d'autant plus remarquable que le streptocoque est lui-même un acidificateur énergique, ainsi que nous le verrons plus loin.

Un grand nombre de milieux peuvent être utilisés pour la culture du streptocoque, qui n’est pas très difficile dans le choix de ses aliments. Parmi les bouillons préparés avec des substances végétales, M. Gabriel Roux a signalé l’eau de touraillons alcalinisée comme un excellent milieu. Nous avons, en effet, obtenu par ce moyen de belles cultures, d’une vitalité très puissante. Nous avons cultivé également Le streptocoque sur l’eau de levure, le moût de bière, le bouillon de navets, à condition d’alcaliniser assez fortement.

Tous les bouillons d'animaux usuels peuvent être utilisés. Nous avons expérimenté le-bouillon de chair humaine, de bœuf, de veau, de lapin, de cheval et de harengs. Les plus volumineuses cultures sont obtenues par le bouillon de veau. Nous verrons plus loin que cette exagération de végétabilité se fait un peu aux dépens de la virulence.

Sur les milieux albumineux liquides, sérum de pleu- -résie, sérum de sang, bouillon albuminé, le développement se fait incomparablement mieux dans le vide qu’au contact

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de l'air. Mais, pour la peptone, le fait est encore plus remarquable. Sur un milieu préparé avec 2 p. 100 de peptone pure, on n'obtient à l'air aucune culture, tandis que le streptacoque se développe abondamment dans le vide atmosphérique. Cette assertion n’est vraic qu’à la condition de se servir de peptone absolument pure. La plupart des peptones du commerce (la peptone Chapoteau, celle des hôpitaux, par exemple) contiennent une grande quantité de matières extractives, aux dépens desquelles le streptocoque peut se développer.

Sur le blanc d'œuf, soit utilisé sans modifications, soit dilué, soit coagulé, nous n'avons jamais obtenu aucune culture. L’adjonction du blanc d’œufau bouillon augmente, au contraire, la nutritivité de ce milieu.

Sur sérum coagulé, le développement est très abondant; mais le sérum est liquéfié dans le vide, alors qu’il ne l’est pas au contact de l’air. L’adjonction de gélose ou de gélatine aux différents milieux liquides, n’enlève rien à leur pouvoir nutritif, mais, en empêchant la diffusion dans toute la masse des chaïînettes et des produits de leur activité vitale, ces substances modifient les conditions vitales du microorganisme ; c'est pourquoi les cultures sur ces milieux ne sont jamais aussi abondantes que sur les milieux liquides.

L’adjonction du glucose ou de glycérine ne semble pas augmenter sensiblement la récolte.

On augmente, au contraire, dans de grandes proportions la puissance végétative du streptocoque, en ajoutant aux milieux liquides de 2 à 10 p. 100 de gélatine et en plaçant les cultures à l’étuve, de manière à maintenir la gélatine à l'état liquide. Le streptocoque se développe alors avec une rapidité et une abondance extraordinaires, en formant déjà au bout de vingt-quatre heures un abondant dépôt grumeleux. Nous recommandons d’une manière toute spéciale le bouillon de bœuf contenant 15 p. 100 de gélaüne, pour la recherche du streptocoque et son isolement

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des microbes avec lesquels il est mélangé. Au bout de vingt-quatre heures de séjour à l'étuve, on examine le dépôt, qui est abondant si la semence contenait du streptocoque. Si les chaïnettes sont en grand nombre, on fait une plaque avec une goutte du dépôt dilué, et l'on a facilement une culture pure. Ce procédé est surtout commode pour la recherche du streptocoque dans la bouche. Il ne réussit pas lorsqu'il est mélangé à des microbes de la putréfaction, par exemple, dans les épanchements péritonéaux. Les milieux gélatinisés sont également un bon milieu de rajeunissement des cultures. On obtient quelquefois des résultats positifs avec des semences qui ne donnaient plus rien sur les autres milieux.

Sous le rapport de la température, le streptocoque est également peu délicat. Il se développe assez facilement à 20 degrés. Néanmoins, sa température de prédilection semble être comprise entre 30 et 35 degrés. Au-dessus, les cultures sont un peu plus difficiles, pour être nulles audessus de 49 degrés.

$ 3. — Produits de culture du streptocoque.

Nous reviendrons sur les effets obtenus chez les animaux par les injections de produits solubles du microbe de . l'érysipèle. Leur composition chimique n’a pas encore été l'objet d’une étude approfondie. Dans les travaux des auteurs qui se sontoccupés de la biologie du streptocoque, la triméthylamine est le seul corps chimiquement défini, signalé comme prenant naissance sous l’action de ce microorganisme.

Nos recherches nous ont conduit à un résultat tout différent. Nous avons analysé un grand nombre de bouillons de culture de streptocoque érysipélateux, et nous n'avons jamais rencontré de triméthylamine. En effet, en chauffant ces liquides fortement alcalinisés par la lessive -

de soude, le produit de la distillation ne contient pas plus de bases volatiles que le bouillon non ensemencé, et l'odeur qui se dégage, franchement ammoniacale, ne rappelle nullement celle de la triméthylamine.

L'absence de cette ammoniaque composée ne doit, du reste, que peu nous étonner, quand nous saurons que le streptocoque, quelle que soit son origine, a une certaine tendance, non pas à produire des corps basiques, mais au contraire à acidifier plus ou moins fortement les milieux sur lesquels il se développe.

Cette acidité des vieilles cultures est un fait absolument constant lorsqu'on emploie les milieux habituellement en usage. Sur les milieux liquides, le bouillon de bœuf, par exemple, nous avons trouvé dans certains cas, par litre, jusqu’à 6 grammes d'acide évalué en acide oxalique. Sur agar ou sur gélatine, il suffit de mettre au contact de la surface de la culture un papier de tournesol bleu mouillé, pour le voir rougir immédiatement et prendre la teinte vermillon, caractéristique de l’action des acides forts. Nous reviendrons, à propos de la vitalité et de la virulence du streptocoque, sur cette fonction acidificatrice, dont les observateurs n’ont jusqu'ici reconnu ni la constance ni l'importance biologique. Seul, Behring la signale accessoirement, au cours d'un article des Archives d'hygiène, concernant un tout autre sujet, et encore en tire-t-il une conclusion que nous croyons erronée.

D’après lui, en effet, le streptocoque du pus acidifierait les milieux, alors que celui de l’érysipèle ne changerait rien à leur réaction. Dans cette différence chimique, l’auteur voudrait voir un moyen de distinguer ces deux microorganismes. Nous verrons plus loin que ces variations de propriétés sont liées, jusqu’à un certain point, aux variations de la virulence. Le streptocoque de l’érysipèle acidifie un peu moins rapidement que le streptocoque du pus, qui constitue une variété voisine, mais le microbe une fois atténué, sa puissance d’acidification apparaît d’une

manière beaucoup plus rapide, et, après plusieurs repiquages, un microorganisme qui acidifiait le bouillon de bœuf en quinze jours, arrive à produire la même réaction dans le même bouillon en dix-huit et vingt-quatre heures.

En règle générale, un streptocoque sécrète de l’acide en quantité d'autant plus grande, par rapport à son poids, qu'il provient d’une culture ayant un degré d’acidité plus considérable. ,

Nous avons surtout étudié les variations de cette propriété, sur du bouillon de bœuf que nous préparions en grande quantité et conservions à l'abri de l’air, de manière à avoir un milieu toujours identique. Il faut, en effet, se défier des moindres changements dans la composition chimique du milieu de culture qui influe, en plus ou en moins, sur la rapidité dans l’apparition de la réaction acide.

En effet, l’adjonction de sucre ou de gélatine au bouillon augmente la quantité d'acide produit. L’addition de glycérine diminue sa production.

L'influence de l'oxygène est assez notable et les cultures anaérobies deviennent, toutes choses égales d’ailleurs, moins rapidement acides que les cultures aérobies.

Sur les autres milieux, l’apparition de l’acide varie suivant leur nature.

Sur le lait, elle est constante et sujette aux mêmes variations que sur le bouillon. Sur la peptone pure dans le vide, l’acidification est très faible. Sur le sérum pleural liquide, elle est complètement nulle, quel que soit l’âge de la culture. Elle n’apparaît point non plus à la surface des cultures sur sérum coagulé.

Nous avons cherché à déterminer quelle était la nature de l’acide sécrété, qui nous a paru être le même dans tous les cas. Nous avons expérimenté sur le bouillon et sur le lait. Pour cela, nous avons concentré nos liquides de culture par distillation, et nous avons constaté que le produit distillé n’était point acide. Dans le lait, néanmoins,

nous avons cependant trouvé une certaine quantité d'acide butyrique, dà probablement à l'action de l'air sur la crème. Mais, sauf cela, la totalité de l’acide se retrouvait dans le résidu restant dans le ballon; nous avons traité ce résidu par l’éther, et, après décantation, nous avons évaporé l’éther au bain-marie. Le résidu de cette opération, abandonné dans un cristallisoir, a donné un liquide visqueux, qui nous a semblé incristallisable.

Par ces caractères, nous pouvions déjà conclure que nous n'avions affaire ni à un acide volatil (acétique, formique, etc.) ; nià un acide cristallisé (succinique, oxalique) ses propriétés le rapprochaient plutôt de l’acide lactique, que MM. Nocard et Roux avaient signalé dans les bouillons de culture du streptocoque de la mammite contagieuse. Nous avons, néanmoins, acquis l'assurance que ce n'était pas non plus de cet acide qu'il s'agissait, en traitant notre résidu par l’oxyde de zinc et en faisant bouillir quelques minutes. Il se produit un sel de zinc soluble, qui reste dans le liquide après filtration. Par évaporation, nous avons obtenu des houppes cristallines très fines et très élégantes, totalement différentes des cristaux de lactate de zinc, dont l’apparence est absolument caractéristique.

La solution limpide de notre acide ne dévie point la lumière polarisée.

En somme, il s’agit là d’un corps organique dont nous n’avons pu déterminer la nature, mais qui s'éloigne des acides que l’on trouve ordinairement dans les produits de cultures des organismes inférieurs (acétique et autres de la série volatile, oxalique, -succinique, lactique, ete.), et qui nous semble devoir appartenir à la série oxygluconique. :

-Si nous avons longuement insisté sur cette sécrétion du streptocoque, les chapitres suivants nous excuseront, en montrant quelles sont les étroites relations entre cette propriété et ses variations de vitalité ou de virulence, qui nous intéressent plus directement.

$ 4. — Vitalité du streptocoque.

Lorsque l’on parle de la vitalité d’un microorganisme, il s’agit plutôt de sa résistance aux conditions extérieures, que d’une évolution analogue à celle des êtres supérieurs. Jamais plus que pour les infiniment petits, la définition de Bichat semble être rigoureusement vraie. Or, comme on ne peut comparer les conditions extéricures d’un microorganisme d’un milieu nutritif inerte à celles qu’il rencontre en se développant dans un organisme vivant, est-il tout à fait illusoire de vouloir conclure de l’évolution d’un microbe 1n vitro à sa manière d’être, lorsqu'il agit comme agent pathogène. Pour le streptocoque, en particulier, c’est une étrange erreur de raisonnement que de vouloir, ainsi que quelques auteurs l'ont fait, voir une relation entre sa mort rapide dans les cultures et la rapidité des processus morbides streptococciques. Nous allons voir, qu'au contraire, si l’on ne tenait pas compte de la réaction organique, Le streptocoque n'aurait aucune raison de mourir dans les tissus.

Les microbes, en effet, ammsi que le démontre la longévité des levures conservées par M. Duclaux, semblent ne point porter en eux, comme les êtres supérieurs, la raison même de leur mort. Leur évolution vitale n’est pas absolument nécessaire. En dehors des spores, que l’on peut comparer aux graines des plantes, et dont la résistance est considérable, les formes adultes de microorganismes sont susceptibles d’une vie latente, pendant laquelle ils ne manifestent pas leur puissance vitale, sans néanmoins la perdre. Il suffit ensuite de leur transport dans un milieu convenable, pour qu’elles prolifèrent à nouveau; c'est un rajeunissement, suivant la si juste et pittoresque expression de M. Duclaux. En un mot, nous pouvons dire que les microbes ne meurent pas, mais qu'ils peuvent plus ou moins facilement être tués.

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Le streptocoque se comporte donc de la manière suivante, lorsqu'il se trouve transporté dans un milieu où se rencontrent les conditions de température et d'humidité nécessaires au développement de tout être vivant. Ou le microbe rencontre des aliments qu'il peut assimiler, el alors la première manifestation du réveil de sa vitalité est sa prolifération, ou, au contraire, le milieu renferme des produits qui lui sont nuisibles et qui le tuent, ou bien encore le microorganisme se trouvant dans des conditions osmotiques qui ne l’affaiblissent pas, ne rencontre dans le milieu ambiant ni substance utilisable, ni produit toxique, et alors il vit d'une vie latenie, jusqu'au moment où il est mis en rapport avec un nouveau corps lui apportant un aliment neutralisant une substance empèchante.

Si l'on songe au développement du streptocoque, on verra qu'il n'y à pas, pour ainsi dire, à considérer l’âge du microorganisme. Les chaînettes augmentent, en effet, non pas par l’adjonction par bourgeonnement d'un ou. plusieurs grains à leur extrémité, ainsi que cela se voit dans le développement du mycélium chez les champignons inférieurs, mais bien par la division portant sur la totalité du protoplasma de chaque grain qui la compose. Nous avons pu suivre ce mode de prolifération sous le champ même du microscope. La formation en chainettes résulte de ce que cette division se fait toujours dans le sens transversal.

Tant qu'il existe des éléments utilisables dans le milieu nutritif, à supposer que les produits de la vie microbienne ne se comportent pas comme des substances toxiques, chaque grain de la chaïînette devrait se diviser dans un temps à peu près égal, et leur nombre croître en doublant continuellement; c’est, du reste, ce processus que l’on constate de visu dans les cultures sur bouillon examinées pendant les premiers jours, et la raison de la forme en chaînettes de diplocoques que nous avons signalée plus haut. On comprend donc qu’au moment où l'aliment serait

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épuisé, tous les grains auraient à peu près le même âge, et si rien ne venait agir sur eux d’une manière nuisible, ils devraient entrer dans la période de vie latente dont nous avons parlé.

On ne peut donc point dire qu'il faut attribuer à la vieillesse les formes involutives que nous avons décrites dans les vieilles cultures. Les grains qui présentent ces apparences sont des grains malades ou des grains morts, et nous devons trouver dans leurs conditions d'existence les causes de ce changement qui, nous le verrons, n'existe que sur certains milieux.

Nous allons donc étudier quelles sont les causes qui peuvent influer en mal le développement du streptocoque, et quelles sont les étapes que peut parcourir le microbe entre sa végétavité normale et la perte totale de sa vitalité.

Si nous nous plaçons uniquement au point de vue vital, les différents degrés que le microbe a à parcourir, sont d’abord, l’arrèt de sa prolifération et son entrée dans la période de vie latente; puis, étant donnée l’absence de spores dans lesquelles toutes les propriétés du microbe adulte persistent ou meurent à la fois, il y a pour le streplocoque, entre le moment où il ne prolifère plus et celui où il est tué, toute une période pendant laquelle il perd peu à peu sa propriété végétatrice, pour ne nous occuper que de celle-ci. C’est cette période que M. Chauveau désigne pour le bacillus anthracis, sous le nom de zone maniable. En effet, cet affaiblissement du microbe est durable, et pendant un certain nombre de générations, on peut, dans un milieu favorable, obtenir une race de streptocoques n’ayant pas absolument les mêmes propriétés que le microbe ayant servi de semence à la première culture. Toutes les influences qui nuisent au streptocoque lui font plus ou moins rapidement parcourir ces différentes phases. |

L'action de la chaleur à été bien établie par Truchot, dont nous avons vérifié les conclusions. Au-dessus de.

42 degrés la prolifération du microorganisme est nulle, mais la puissance végélative n’est atteinte qu’au bout d'un temps très long ; à mesure que l’on élève la température, la mort du microorganisme arrive dans un temps de plus en plus court. En dix minutes, le streptocoque est complètement tué par une chaleur de 80 degrés. Du reste, la question de l’action de la chaleur est elle-même complexe. Cette action est plus nuisible au contact de l'air que dans le vide, dans les milieux liquides qu’à sec, et principalement sur les cultures acides que sur les cultures neutres ou alcalines.

Ce rôle de l'acidité sur la vitalité du streptocoque est capital, même à la température ordinaire. Tant que la culture est alcaline ou neutre, les microbes jouissent dans les repiquages d’une puissance végétative considérable et forment au fond du ballon un beau dépôt grumeleux bien typique. Si l’on a soin de faire des cultures successives sur le même milieu avant l’apparition de l'acidité, la végétativité croît au lieu de décroître, et l’on a, pour ainsi dire, de véritables races de laboratoire, donnant sur la gélatine ou l’agar des colonies beaucoup plus volumineuses que celles des premières cultures, acidifiant les bouillons moins rapidement et douées d’une assez grande résistance.

Si, au contraire, on fait des repiquages tous les jours, à partir du moment où l'acidité est apparue dans le milieu, on obtient des cultures de plus en plus grèles, au point de devenir à peine visibles sur agar et sur gélatine. Sur bouillon, le dépôt est fort peu abondant et ne se forme plus en petits grumeaux.

L'examen microscopique de ces cultures acides fait voir un grand nombre de ces formes involutives que nous avons signalées sur les repiquages ; les chaïînettes ont diminué de longueur et de largeur, elles sont grèles. Les grains, au nombre de quatre au plus, sont mal séparés, et on pourrait les prendre pour des bacilles contenant des spores.

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Ce qu'il y a de plus curieux, c’est que, dans les repiquages, l’acidité apparaît d'autant plus rapidement que la semence provient d’une culture elle-même plus acide. Au bout de douze heures, les grêles cultures dont nous venons de parler rougissent fortement le papier de tournesol: et l'acidité venant aussitôt s'ajouter aux autres causes de dépérissement du microbe, il se trouve ainsi enfermé dans un cercle vicieux et meurt au bout de trois ou quatre cultures, s’il n’est pas transporté sur un milieu sur lequel il ne puisse pas produire sa sécrétion acide.

Sur le sérum sanguin ou pleural, au contraire, après avoir fourni un développement plus ou moins abondant, suivant le cas, le microbe passe à l’état de vie latente et, conservant sa vitalité, peut se repiquer après un temps fort long sans avoir perdu de sa force végélatrice. Roger prétend en avoir conservé un an. Nous croyons qu'une limite supérieure peut être atteinte en maintenant le microbe à l’abri de l'oxygène de l'air. Dans aucun cas, nous n'avons trouvé dans ces cultures sur sérum les formes d’involution que nous avons signalées dans les vieilles cul- {ures sur bouillon.

L’acidité, si elle est plus active, n’est néanmoins pas la seule cause de mort des streptocoques dans les milieux artificiels. Pour le démontrer, nous avons cultivé des streptocoques de diverses provenances, en présence du carbonate de chaux, qui neutralisait l'acide au fur et à mesure de sa production. Les microbes vécurent beaucoup plus longtemps, mais, néanmoins, nous ne pûmes en obtenir de nouvelles cultures après quatre mois. Outre la

possibilité de la production d’autres corps toxiques, nous croyons que certaines autres influences nuisentà la vitalité du microorganisme. C’est, par exemple, l’action de l’oxygène, car les cultures se conservent mieux dans le vide qu'au contact de Pair; en second lieu, nous devons signaler la puissance de diffusion du milieu sur lequel le . microbe est cultivé. En cela, l’excès et le défaut sont éga-