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Toute méthode histo-chimique utilisant lacidesulfurique concentré paraît à rejeter à priori, Ce réactif en effet est extraordinairement brutal et enlève toute possibilité de conserver la préparation pour l’examiner à loisir. Au bout d’un temps assez court, la fine organisation des cellules est détruite.

Par ailleurs, il ne faudrait pas croire que cette réaction très sensible et étroitement spécifique détecte le cholestérol dans la cellule même. Elle ne fait que localiser dans une région : il s’agit seulement d’une topographie assez peu précise.

Tout ce que l’on peut admettre, c’est l’utilisation possible de cette méthode modifiée, pour situer les stérols dans les tissus végétaux, par exemple dans les graines. Des expériences nous ont montré que le tissu végétal plus résistant supporte mieux l’action brutale de lacide sulfurique, mais la coloration est également fugace (1).

Enfin, dernier inconvénient de la réaction de LIE- BERMANN, elle ne distingue pas le cholestérol libre du cholestérol éthérifié. Nous montrerons plus loin

que cette distinction est parfois fort intéressante.

93) LA LUMIÈRE POLARISÉE DONNE DES RÉSULTATS SURS. ET DURABLES, MAIS NE DÉTECTE QUE LES ÉTHERS

l DU CHOLESTÉROL ET CERTAINS PHOSPHATIDES.

Aussi la méthode optique, par ses résultats précis: et durables, a-t-elle, dès que connue, retenu Patten-tion des chercheurs.

(1) MiRANDE [243] au cours de ses observations sur les stérinoplastes du bulbe de lis a utilisé des réactions analogues en vue de la diagnose de substances chimiques contenues dans les. organites élaborateurs.

Déjà en 1857, METTENHEIMER (d’après CrAGGI0 | 1671) signalait la présence de gouttelettes biréfringentes dans les foyers athéromateux de l'aorte. En 1866, DARESTE (d’après Muron |[250]) découvrait dans les capsules surrénales de la tortue des corps présentant la croix de polarisation et qu’il crut être de l’amidon. DasrRe [174] démontra qu’il s'agissait de lécithine. C’est à KaAISERLING en 1895 (d’après TOURNADE [191]) qu'on doit la diffusion de la méthode optique.

C'est d’ailleurs KAISERLING qui, un des premiers, rencontra dans la surrénale de Mammifères, des corps biréfringents, c’est-à-dire capables de rétablir la lumière lorsqu'ils sont placés entre deux nicols croisés. En effet, une coupe récente de surrénale de cobaye présente en certains points bien déterminés des gouttelettes ayant en lumière directe tous les aspects de globules de graisse, mais qui s’en distinguent en lumière polarisée. Tandis que la graisse neutre est isotrope, ces sphéroïdes sont lumineux et présentent le phénomène de la croix de polarisation.

Mais de ces « cristaux liquides », certains cristallisent sous l’action du formol, ou du froid intense (gaz carbonique) et gardent en lumière polarisée une magnifique biréfringence.

Chauffés à 50/60°, ils perdent leur anisotropie, qu’ils retrouvent en revenant à la température ordinaire, tandis que d’autres gouttelettes qui ont résisté à l’action du formol et du froid, continuent à 60° à présenter le phénomène de la croix.

Les opinions ont été longtemps très partagées sur

l'identité de ces substances. BABÈs [148] se contentait

Pire

de remarquer. que la présence des « cristalloides > coincidait avec les régions riches en graisse. Les recherches de MuLoN [250], d’ASCHOFF [146], de KawamurA [207], de WELTMANN {286] semblent bien démontrer que ces gouttelettes biréfringentes qui se dissolvent avec facilité dans les solvants neutres, sont constituées au moins par deux groupes de substances : des éthers du cholestérol, qui cristallisent par le froid ou sous l’action du formol et perdent à chaud leur anisotropie, et des phosphatides qui conservent leur anisotropie, sauf à très haute température. Winpaus [288] confirme ces données : ses expériences sur les reins pathologiques lui ont permis de constater que les produits biréfringents étaient d’autant plus abondants que le tissu était plus riche en cholestérol éthérifié.

Sans doute pourrait-on, en vue de distinguer dans cette biréfringence la part qui revient aux phosphatides, utiliser leur insolubilité dans l’acétone où les éthers du cholestérol sont très solubles. Cette méthode de dissolution fractionnée offre en histo-chimie fort peu de sécurité. Il faut donc se contenter de la distinction grossière par la chaleur, (Gross, d’après V. PATzELT [256]), ou d'admettre que les produits biréfringents groupent éthers du cholestérol et phosphatides.

SE D L’histologie par des procédés divers a étudié la

détection et la localisation de l’ensemble et de cha-

cun des lipides dans la capsule surrénale. La méthode

Ur

chromatique détecte et situe l’ensemble, sans apporter d'idée spécifiquement qualitative. Sans doute Pacide osmique est-il capable de distinguer entre les graisses « labiles », solubles dans le xylol, et les graisses « indélébiles » insolubles dans le même réactif. Ce n’est là qu’un point de départ pour des recherches ultérieures (BERNARD et BiGArT, MUuLoON). Les méthodes des réactions colorées donnent une idée qualitative (cholestérol total) et une vague localisation; tandis que le microscope polarisant a l'avantage de localiser étroitement un des éléments importants des lipides, les éthers du cholestérol. Malgré cet avantage, cette méthode est loin d’être parfaite. Limitée dans ses applications (seul le cholestérol éthérifié, figuré, est détecté) elle peut prêter à confusion avec les phosphatides. Mais surtout elle ne détecte pas tout le cholestérol éthérifié (THAYSEN [28G)).

Nombreux sont les auteurs qui pensent que seule la chimie est capable de révéler tout le cholestérol des tissus (PoLiCARD [258 |, FEx [179], SorG et JAFFÉ [273 |).

Cependant, à peu près tout ce que l’on sait de précis sur la répartition des « lipides » des surrénales, a été appris par la méthode physique. — La répartition des lipides biréfringents groupés dans la corticale est à la base de théories sur le rôle du cortex surrénal dans le métabolisme du cholestérol (BaAuMANN et Hozzy [152)). ‘ C’est à elle qu'est due la notion de l’étroite localisation des éthers du cholestérol notamment dans la couche spongieuse (spongiocytes), le reste de la fasciculée et la zone externe de la réticulée. — De plus pour BaGixskr [150] le nombre des particules biré-

TUNER

fringentes ne présente que des changements insignifiants d’un animal à l’autre, mais en réalité il y a des variations notables avec l’espèce et ceci explique souvent les divergences et les idées en apparence opposées de certains auteurs. Ainsi KawamuRA [207], Sora et JAFFÉ [273] ne trouvent pas de cholestérol éthérifié chez les Ruminants, sauf chez le veau; tandis que MuLox [250] et tous les histologistes signalent l’extraordinaire abondance des éthers chez le cobaye. Comme le cholestérol total, les particules biréfringentes varient aussi selon l’âge, le moment, les conditions de vie. Quelles que soient les méthodes d'analyse employées, les histologistes s’accordent pour démontrer l'abondance des lipides dans la corticale seule (MULON [250]), la médullaire présentant une composition très différente.

B. MÉTHODE AUX SAPONINES

I. Certaines saponines, en particulier la digitonine, donnent avec le cholestérol libre des combinaisons cristallisées susceptibles d'être utilisées en histochimie.

En chimie on ne possède pour détecter et pour doser le cholestérol libre qu’une méthode sûre, celle de WixDAUS |289] à la digitonine. Nous savons depuis Houpas, RaNsoM et d’autres quelle affinité possèdent les saponines pour les corps à fonction alcool ou phénol. Les saponines, la saponine du Quillaya, la sapu-

nine du Sapindus, la gaiac-saponine, la dioscine (YAG@I

1292)), la cyclamine, la digitonine ont toutes un pouvoir hémolvtique plus ou moins accusé (KOFLER | 210 |) que la présence de certains corps à oxhydrile libre neutralise biologiquement (HAUSMANN, ABDERHALDEN €t LE COUNT, d’après KorLER [210]). C’est ainsi qu'avec le cholestérol, la réaction qui se passe par addition de une (digitonine, cyclamine) ou plusieurs (dioscéine) molécules de saponine, a une stabilité variable et se prête plus ou moins à l’isolement d’un complexe pur et cristallisé dépourvu de propriétés agressives vis-à-vis des hématies.

Parmi les saponines, Winxpaus [288|) choisit la digitonine parce que cette saponine, qu’on peut exceptionnellement obtenir cristallisée, est capable de détecter le cholestérol dans un mélange comme linsaponifiable des graisses, et de l’isoler en un complexe stable et de composition connue.

WinpauUs, dont les premières expériences portaient sur le cholestérol des reins pathologiques [289], put distinguer quantitativement les proportions relatives de cholestérol libre et éthérifié.

L'action de la digitonine est restée très générale. Elle s’applique à un grand nombre d’alcools et de phénols (Wixpaus et WEINHOLD [290]) et tous les stérols sont justiciables du procédé. Aussi KLEIN et PIRSCHLE ![209] après avoir isolé les phytostérols du latex d’Euphorbes, tentèrent-ils de les détecter directement dans le latex lui-même. Ils appliquaient ainsi les premiers cette propriété à l’histo-chimie.

LEULIER et NoEL [225] y virent une élégante méthode à utiliser en histo-chimie animale. Leurs expé-

re

riences sur les surrénales de cobaye furent couronnées de succès.

Réaliser in situ la précipitation de cristaux stables semble l'idéal de lhisto-chimie, mais à condition d'identifier à coup sûr ces cristaux sous le microscope, et cela avec aisance. Dans cette vue, LEULIER et NoEL utilisèrent les premiers la biréfringence que présente le complexe cholestérol-digitonine cristallisé. Il va sans dire que dans un tissu optiquement vide, c’est-à-dire ne possédant pas avant l’expérience de cristaux ou de particules biréfringentes, Pexamen est facile et le risque d’erreur limité. Ce n’est pas le cas de la surrénale du cobaye, où les éthers du cholestérol abondent, remarquables par leur biréfringence bien plus intense que celle du complexe cholestérol-digitonine.

Aussi la question s’est-elle posée d’améliorer la méthode de LEULIER et NoEL et de la rendre applicable à tous les tissus animaux. Sans doute aurionsnous pu choisir comme terrain d’étude des surrénales pauvres en cholestérol éthérifié. Cela aurait singulièrement simplifié nos recherches sur la signification des cristaux obtenus. Nous avons préféré choisir le cas le plus délicat, celui où les éthers abondent, tandis que le cholestérol libre n’existe

qu’en proportion relativement faible : la surrénale du cobaye.

Il. Etude de l’action des saponines sur le cholestérol in vitro.

Avant d'appliquer à notre tour la réaction de

Rio

Winpaus, à la recherche histo-chimique, nous avons jugé indispensable d'étudier la réaction in vitro.

Notre étude a porté sur l’action de trois saponines : digitonine (1), saponine du Quillaya, et gaiacsaponine.

La digitonine employée présentait la plupart des caractères décrits par REICHARD [2671 et MELANOFF [240] : solubilité dans l’acide sulfurique qui donne une solution limpide à froid. Elle cristallisait par évaporation lente de ses solutions alcooliques. L’éther la précipite entièrement de ses solutions dans l’alcool dilué, où elle est très soluble (LauparT [219)).

La saponine du Quillaya était amorphe, soluble dans l'alcool faible, en donnant une solution légèrement jaune, et insoluble dans l’éther.

La gaiac-saponine amorphe possédait comme les deux saponines précédentes un pouvoir hémolysant intense. .

Nous avons successivement étudié les caractères de formation des complexes que donne le cholestérol avec ces trois saponines, et les propriétés micro-chimiques de ces complexes.

A. AVEC LA DIGITONINE.

. C’est sur le complexe cholestérol-digitonine qu'ont

porté surtout nos recherches.

a) Conditions expérimentales de formation du complexe.

Nous avons étudié in vitro les conditions d’obten- (4) Nous avons utilisé de la digitonine Merck, et de Ia digito-

nine, saponine du Quillaya et gaiac-saponine que la Maison Roche avait gracieusement mises à notre disposition.

tion du complexe à l’état cristallisé. Elles sont réglées par la concentration et le degré alcoolique, la température, le temps laissé à la précipitation.

La solution de digitonine, à cause du peu de solubilité du cholestérol dans lalcool faible, doit être effectuée dans l'alcool de titre assez élevé, 50°, et même s’il s’agit de solutions relativement concentrées, 1 p. 100 par exemple, dans l’alcool à 90°, sinon on s’expose à précipiter le cholestérol lui-même, ce qui peut être une cause de difficultés dans létude du complexe pur. Il faut employer un excès de digitonine, environ 4 fois plus de digitonine que de cholestérol supposé.

Les solutions alcooliques de cholestérol étaient à deux concentrations, l’une à 0,40 p. 100 dans l'alcool à 90°, l’autre à 1 p. 2000 dans l’alcoo!l faible.

Pour obtenir un complexe bien cristallisé avec les solutions concentrées il faut précipiter à l’ébullition; l'addition de quelques gouttes d’eau, de façon à ramener le titre de l’alcool à 85° environ, accélère la précipitation et favorise la cristallisation.

Si l’on part de solutions très diluées, et dans l’alcool faible (ce qui est important, sinon la précipitation aurait difficilement lieu), il semble que ce soit la précipitation à froid, pendant des semaines, qui donne les meilleurs résultats.

Les cristaux qui se sont formés lentement sont plus gros et leur biréfringence est plus marquée.

b) Caractères de la réaction.

Cette réaction est intéressante par sa spécificité et sa sensibilité relative, mais largement suffisante.

RMS IT

Spécifique, elle l’est dans les conditions que nous rencontrerons en histo-chimie. Il existe peu d’alcools ou de phénols libres dans la vie animale où les processus d’oxydation ou de réduction sont rapides. D'ailleurs, si cette réaction n’était pas spécifique, les dosages chimiques qui l'utilisent seraient entachés d'erreur, et ce serait étonnant, puisque de très nombreux auteurs l’ont étudiée, modifiée, adaptée et que tous s'accordent sur sa valeur.

La réaction est sensible, WinpaUs la dit capable de détecter 0,02 de cholestérol dans 100 cc. de liquide, sensibilité suffisante en histo-chimie.

La réaction est constante. Le cholestérol adsorbé par le charbon en est arraché par la digitonine (EiscEr, d’après KoFLER [210]), de même, le cholestérol est détecté facilement au sein d’un mélange de substances grasses, de pigments (HESss, THAYSEN [193]). C’est le cas en histo-chimie où d’emblée :il faut pratiquer la réaction de diagnose sans essai d'isolement préalable.

c) Caractères du complexe.

Le complexe cholestérol-digitonine cristallise en fines aiguilles le plus souvent groupées en rosettes qui paraissent, dans le cadre limité qui nous occupe, tout à fait caractéristiques. Partant d’une solution pure de cholestérol, et d’une ‘solution également pure de digitonine, aucune confusion n’est possible. Si les deux solutions ont le même titre alcoolique, le cholestérol ne peut précipiter, non plus que la digitonine : le produit cristallisé qui se forme ne peut être

que le complexe.

ANR.

En histo-chimie, le cas est beaucoup plus délicat. Le caractère de probabilité est insuffisant : il convient d’utiliser les caractères du complexe pour le distinguer de façon sûre.

Les rosettes présentent une biréfringence nette, quoique difficile à percevoir au premier abord, et qui semble s’atténuer un peu par dessiccation. Elle permet de repérer les cristaux en lumière polarisée, et de les retrouver en lumière directe. Néanmoins, la clarté qui limite les cristaux n’a qu’une valeur relative. Elle est de l’ordre du tiers de celle des éthers du cholestérol; aussi faudra-t-il en histo-chimie réunir tous les moyens capables d'améliorer la vision : bon éclairage du microscope, écran protégeant l’observateur, objectif de faible grossissement.

Les cristaux et leur mode de groupement sont sfables. L'action de la chaleur faible, des colorants, des réactifs dissolvants les laissent inaltérés.

À la température de 50/60°, les cristaux demeurent biréfringents, et ceci permet de les distinguer dans une coupe des éthers du cholestérol, qui deviennent obscurs à cette température.

Les solvants n’ont pas, lorsqu'ils sont employés avec précaution, d'influence sur la présentation du complexe. Ainsi l’alcool à 70° qui dissout lentement les éthers du cholestérol, ne touche pas aux cristaux du complexe. Au contraire, on sait que l’alcoo!l absolu les dissout quelque peu (0,014 p. 100, GaARDNER et WicziamMs [185]), de même que léther éthylique (0,0007 p. 100), et l’eau bouillante (0,006 p. 100) (H. MUELLER [249]). Dans une coupe, qui contient de très

faibles quantités de cholestérol libre, l'alcool absolu emjiloyÿé comme solvant des éthers du cholestérol aurait tôt fait de solubiliser le complexe.

L'alcool fort et l’éther ont surtout l'inconvénient de détruire la structure cristalline du complexe. C’est là un obstacle à son identification : une fois amorphe,

toute biréfringence a naturellement disparu.

Enfin, la biréfringence du complexe est maintenue en présence de matières colorantes. Le Soudan III qui fait disparaître les propriétés optiques des éthers du cholestérol (LANGERON [216], TOURNADE [19:)), n’altère nullement celles du complexe. Peut-être ce phénomène se ramène-t-il à l’action dissolvante de l’alcool à 70°, employé comme solvant du Soudan, qui

dissoudrait les éthers et laisserait le complexe intact.