CHAPITRE IX

Méthodes employées.

4. — Localisation miero-chimique : nous avons utilisé la technique générale indiquée par Errera, 1886, et qui est couramment employée à l’heure actuelle dans les laboratoires où l’on étudie les alcaloïdes dans les plantes.

Le principe de cette méthode qui permet de différencier les alcaloïides des matières protéiques tous deux précipitables en brun kermès par le réactif à l’iodure de potassium iodé,est le suivant : les alcaloïdes sont solubles dans l'alcool tartrique alors que les matières protéiques ne le sont pas. Donc:

1° Traiter les coupes par le réactif de Boucrarpar; 2e Traiter d’autres coupes provenant du même organe par l'alcool tartrique, puis par le réactif iodo-ioduré de Boucrarpar; 3° examiner par comparaison les deux séries de coupes : si le tissu examiné renferme uniquement des alcaloïdes le précipité rouge que l'on observait dans certaines cellules de la {re série de coupes, n'existe plus dans les coupes de la seconde série ; si la plante renferme uniquement des matières protéiques, le précipité persiste ; enfin si la plante renferme à la fois alcaloïdes et matières protéiques, il y a un précipité dans les deux séries, mais moins abondant dans la seconde. Dans ce dernier cas, exemple dans les graines, la localisation des alcaloïdes sera plus difficile à effectuer.

Technique opératoire : Coupes de racines, tiges, feuilles,

fleurs: a) on fait des coupes transversales suffisamment épaisses

(au moins une assise de cellules entières) et des coupes longitudinales,que l'on dépose et laisse dans le réactif pendant un temps variable suivant l'organe envisagé. On relire et on monte dans une goutte de glycérine.

b) D'autres coupes séjournent dans l’alcool tartrique pendant 24 heures en ayant soin d’agiter de temps à autre pour renouveler les surfaces et favoriser la dissolution de l’alcaloïde. On retire, on lave et on fait agir le réactif de Boucarpar pendant lé même temps que plus haut.

c) On compare au microscope les deux coupes.

Le travail de Jacquemin nous a servi de guide et nous avons procédé comme lui par examen successif des différentes parties de la plante. Nous avons pu contrôler sur la plupart des organes du Lupinus mutabilis la localisation indiquée par JAcque- M ; en particulier dans le tégument de la graine nous n'avons constaté aucune précipitation: l'examen chimique (voir page ) reste d’accord avec cette observation ; par contre, ii nous a été absolument impossible de faire une localisation nette des alcaloïides dans l'amande (cotylédons) à cause de l'abondance des matières protéiques. Nous le regrettons car nous aurions pu, comme Van Dicx l’a écrit en 1900, suivre les variations dans les cotylédons au cours de la germination, ce qui nous a été très difficile par cetle méthode.

Nous avons constaté un nombre moins grand de cellules renfermant des alcaloïdes dans les tiges de plantes âgées, par rapport à celles de tiges jeunes, mais nous n’avons pu trouver de différenciation bien netle dansles feuilles.

Dans l'étude de l’action des engrais nous avons bien observé une plus grande intensité de coloration dans les tiges avec certains engrais par comparaison avec le témoin, sans pouvoir affirmer qu’elle était due à une plus grande proportion d’alcaloïdes.

2. — Détermination de la teneur en alealoïdes. — a) Nous avons cherché la meilleure méthode à utiliser pour suivre les variations des alcaloïdes dans la plante, cultivée dans diverses condi-"

tions. Nous avons apporté le plus grand soin à l'établissement de cette méthode, ce qui nous à demandé un temps assez long (près d'une année). Car nous pensons qu'il est absolument nécessaire d’avoir bien en main une manière d'opérer suffisamment précise avant d'entreprendre l'étude des variations des teneurs en alcaloïdes chez les végétaux. Il est toujours facile d'obtenir des chiffres, il est indispensable de pouvoir assurer qu'ils ontété obtenus par des procédés qui apportent toute la précision désirable en ces sortes d'analyses.

1) Principe : la méthode que nous avons adoptée définitivement (1924) et que nous avons utilisée sans modification pendant toute la durée de nos expériences est basée sur le principe suivant : {. extraire les alcaloïdes avec l’éther sulfurique officinal après déplacement par un alcali ; 2. les reprendre par SO#H? dilué ; la solution aqueuse de sels d'alcaloïdes est traitée par l'acide silico-tungstique (1) ; 3. le précipité insoluble de silicotungstate d'alcaloïde est lavé, séché, incinéré ; 4. du poids du mélange de silice et d'anhydride tungstique trouvé, on déduit le poids: d'alcaloïdes correspondant en multipliant par un coefficient vérifié expérimentalement.

2) Technique opératoire. — 1. Précautions employées pour l'obtention du matériel d'analyses :

a) Opérations préliminaires avant la dessiccation : Les organes furent toujours recueillis sur les plantes aussitôt la récolte de celles-ci. Les feuilles furent loujours coupées au ras de la tige, c'est-à-dire à la base du pétiole, à l'aide de ciseaux ; car, ainsi que Ripert l'avait déjà fait observer en 1922, et ainsi que nous avons pu le constater {par des expériences précises, les feuilles qui sèchent sur tige mettent plus longtemps à sécher, leur vie est en quelque sorte prolongée et, à poids égal de matière sèche, elles sont plus riches en alcaloïdes que celles que l'on a détachées avant la dessiccation.

1. Suivant la méthode générale indiquée par G. BERTRAND : sur l'emploi de l'acide silicotungstique comme réactif des alcaloïdes. Bull. Soc. chim. (3) 21, p. 434, 1899.

Il y a lieu de tenir compte également des feuilles jeunes, vert foncé, qui sont en pleine période d'activité biologique, et des feuilles âgées telles que celles de la base de la tige, dont la coloration tire sur le jaunâtre. Les premières sont beaucoup plus-riches en alcaloïdes que les autres ; des expériences (que nous exposerons dans la suite) ont permis de nous en rendre compte d’une façon exacte. C’est pourquoi, dans de nombreuses expériences, nous indiquerons dans les poids de récolte : les feuilles totales et les feuilles jeunes ; le dosage des alcaloïdes portera sur les lots de feuilles jeunes.

Les tiges ne furent jamais séchées entières, car leur dessiccation aurait été beaucoup trop longue (en particulier avec les grosses tiges de 4 cc. de diamètre que nous avons obtenues sous l’action de certains engrais) et il se serait produit des fermentations amenant despertes en substances azotées et en alcaloïdes. Pour éviter ces inconvénients, nous ies avons divisées en quatre longitudinalement, puis, coupées ensuite en fragments de 2 cm. de long : ceux-ci présentaient alors une surface de dessiccation beaucoup plus grande et séchaient rapidement. Les racines furent coupées et sectionnées de même ; le couteau n'était plus suffisant le plus souvent pour obtenir ce résultat : il fallut employer le coupe-racine.

Les fruits furent ouverts, les graines relirées des gousses et celles ci divisées en fragments longitudinaux, puis transversaux.

Il est utile de rappeler que la récolte fut toujours effectuée par temps sec, et que les organes qui furent pesés à l'état frais, n'avaient aucune trace d'humidité à leur surface.

b) La dessiccation : le principe qui nous a guidé fut celui d'opérer la dessiccation le plus rapidement possible et à une température peu élevée, voisine de 35° (1). Pour cela nous avons utilisé la grande étuve de ScuriBaux, bien aérée et réglée à + 35e.

1. Nous verrons dans la suite que la température de 35° n’est pas la plus -favorable à la dessiccation pour éviter les pertes en alcaloïdes, ainsi que nous le démontrerons expérimentalement en 1929.

A l'arrivée au laboratoire, les plantes fraîches, préparées ainsi qu'il est indiqué plus haut, par organes et par lots, étaient étalées sur papier filtre reposant sur les trois rayons de l'étuve.

C) Pulvérisation : après un séjour variable à 35° suivant les organes, ceux-ci étaient ou pulvérisés dans un mortier jusqu’à poudre fine (feuilles, fleurs) ou passés au moulin à calé (graines, gousses, tiges, racines). Les graines étaient pulvérisées jusqu'à obtention de 50% de poudre traversant le tamis no 40 : la poudre tamisée et le résidu étaient mélangés intimement de façon à avoir une poudre bien homogène.

Les lots d'organes ainsi pulvérisés étaient remis à l’étuve à 350 pendant 48 heures ; les prises d'essai étaient faites pour les dosages soit des alcaloïdes, soit de l’azote total, et une autre prise d'essai de 10 ou de 5 gr. était effectuée pour le dosage de l'humidité restante, par séjour à l’étuve à 1000 jusqu'à poids constant.

2. Dosage des alcaloïdes : 1) Agiter la poudre d'organes pendant 12 heures (10 fois pendant quelques minutes) dans un flacon bouchant à l’émeri, avec 100 cm° d’éther sulfurique officinal et 15 cm* de solution de lessive de soude à 10 %. Repos 12 heures ;

2) Décanter la solution éthérée dans un verre et prélever V cmÿ d'éther (1) dans une ampoule à décantation : ajouter X gouttes de solution alcoolique d’hélianthine à 1 %, puis 10, 15 ou 20 cm° SO‘H? N/10 jusqu’à virage au rose obtenu après agitation soignée. Laisser reposer ; soutirer la partie aqueuse dans une fiole d’'Erlenmeyer ; reprendre l’éther à deux reprises par 10 cm° SO“H? N/10, agiter et décanter chaque fois dans la liqueur acide après repos. S'assurer que le dernier liquide de lavage, privé d’éther, ne donne plus aucun louche avec l'acide silicotungstique.

3) Chauffer au bain-marie le liquide acide pour chasser