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Nous avons été victime nous-même d’une erreur de technique par suite du désir que nous avions d’instituer nos recherches d’après les indications primitives de Büchner. Nous le signalerons dans la suite, car elle nous semble d'un enseignement utile.

Depuis, nous n’avons jamais manqué d'observer le principe que nous avons énoncé ci-dessus, et les liquides qui nous ont servi dans la recherche des diastases ont tous été filtrés sur bougie avant leur emploi immédiat. Est-ce à celte cause que nous devons de n'avoir guère à enregistrer que des résultats négatifs ? Nous ne le pensons pas, car nous verrons de quel moyen nous avons pu modifier la facullé de rétention des diastases par les bougies de porcelaine.

Si nous considérons maintenant les lois générales de sécrélion des diastases, il est un autre principe dont on doit tenir compte : il est: admis et prouvé qu'il y a un rapport étroit entre la diastase secrétée par un microbe, et l'aliment qui lui est fourni, quand cet aliment n'est pas directement assimilable et a besoin de subir une transformation préalable : une levure modifie son pouvoir diastasique suivant le sucre qui lui est fourni ; l’aspergillus glaucus secrète de la sucrase, s’il est en milieu sucré où l’azote existe sous forme minérale ; s’il se développe dans du lait, il secrète en outre de la présure et de la caséase. Il n’est pas utile de multiplier ces exemples, c’est une loi généralement admise ; elle est discutée quand il s’agit de diastases secrétées par les cellules des animaux supérieurs: celles du canal digestif, estomac ou pancréas, possèdent bien toujours des propriétés fonctionnelles identiques en apparence, indépendantes du mode de nutrition de l'organisme, mais il faut tenir compte du milieu intérieur dans lequel elles se trouvent, et qui ne subit que faiblement le contre-coup des changements dans l'alimentation.

C'est donc avec cette idée directrice que nous avons entrepris nos recherches.

Expériences personnelles.

En premier lieu, nous nous sommes demandé si le coli bacille secrétait une diastase des matières protéiques, agissant spécialement sur les peptones. Notre microbe se développant très bien dans de l’eau peptonée pancréatique à 3 pour cent, nous ensemençons 2 ballons de 300 cc3 avec chacun de nos échantillons.

Le milieu se trouble rapidement, l’indol est déjà abondant au boul de 2 jours; nous laissons à l’étuve pendant un mois afin d’avoir une sécrétion de diastase aussi abondante que possible ; nous filtrons sur bougie sous pression d'air, après décantation qui permet une première épuration. Le milieu est alcalin ; or, les travaux de Holderer sur l'influence de la réaction dans la filtration sur bougie des solutions diastasiques lui ont permis de conclure que cette filtration est favorisée par l’alcalinisalion, tandis qu’en milieu acide, la diastase est presque entièrement retenue. Nous nous trouvions donc dans un milieu favorable pour effectuer notre expérience.

-Nous recueillons 80 cc3 de liquide pour chacun de nos ballons de 300 cc. Nous en faisons l'essai en mettant quelques centicubes dans deux tuhes stérilisés ; il n’y a pas de trouble après 4 jours d’étuve ; nous sommes donc bien en milieu stérile, ne devant tontenir comme substances aclives que des diastases.

Nous préparons une série de tubes de 10° d’eau peptonée pancréatique analogue à celle des ballons et nous ajoutons dans 10 de ces tubes, 1, 2, 3, 4, 5 goultes , etc. de filtrat , en nous servant alternativement des filtrats A et B. Nous mettons à l’éluve et 4 jours après nous faisons la recherche de l’'indol par la méthode à la vanilline.

Nous obtenons bien une réaction positive, mais nos fil-

L'ART ENRER

trats contenaient déjà de l’indol ; aussi, comme témoin et comme point de comparaison, à chacun de nos essais nous ajoutons dans un tube semblable d’eau peptonée, la même dose de filtrat, et nous y faisons la réaction aussitôt ; dans lous les cas, nous avons constaté que la coloration était la même que celle du témoin, preuve que le séjour à l’étuve n'avait pas provoqué de réaction du filtrat sur la peptone, et cependant, la température de 37 degrés est la tempéraralure oplima moyenne des diastases.

Pensant peut-être que la quantité n'était pas suffisante, nous ajoutons non plus 1,2,3 gouttes de filtrat, dans les lubes, mais 1,2,3cc3 et nous abandonnons 15 jours à l’étuve. En employant toujours le même mode de recherche, et les mêmes témoins que précédemment, nous n'avons pu déceler de production d’indol sous l'influence d’une diastase.

Nous faisons agir ensuite notre filtrat sur des tubes de bouillon au neutral-roth ; nous nous assurons que l’alcalinité n’est pas suffisante ‘pour le faire virer immédiatement ; nous ajoutons comme auparavant des doses croissantes de filtrat ; jamais nous n’avons pu observer ni virage, ni fluorescence, ni production de gaz, quel que soit le temps d’étuve -qui a été jusqu'à 1 mois.

La filtration des bouillons ne permet donc pas d'isoler une diastase proléolytique, trypsine ou autre qui puisse reproduire les deux réactions connues du coli-bacille sur la malière azotée: virage et fluorescence du neutral-roth, productior d’indol.

Dans l'exposé de cette Première expérience, nous nous sommes étendu à dessein un peu longuement, afin de montrer la marche générale suivie dans le courant de ce travail ; les autres seront décrites plus brièvement, elles ont été faites dans les mêmes conditions, suivant les mêmes principes

Avant d'abandonner l'espoir de trouver une diastase des protéiques chez le coli, nous tentons un autre procédé, employé par Hähn, qui extrait de la levure, par broyage

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des cellules, un suc qui renferme une trypsine et qui en aurait découvert de même ‘chez les microbes de la fièvre typhoide et de la tuberculose. Il est certain que cette technique permet d'extraire ce que la cellule secrète el ne répand peut-être pas dans le milieu où elle vit; en un mol, on peut se rendre compte, s’il y a des endodiastases par opposition aux exodiastases qui diffusent dans les liquides de culture. |

Pour cela, il était nécessaire d'avoir une quantité de microbes suffisante pour être trailée par le broyage;: 2 moyens se présentaient, employés déjà par d'autres auteurs: le premier (Meisenheimer) était de faire des cultures liquides et par centrifugation d'isoler la masse microbienne. Nous l’avons essayé, nous n'avons pu avoir qu'un tout petit dépôt, impossible à manipuler. Le second, c'était d'agir en milieu solide et de recueillir les microbes par râclage. Nous préparons 5 bouteilles de Leune, avec de la gélo-peptone, milieu contenant de l'azote, où nous avions trouvé de l’endol, et pouvant permettre la production d'une diastase correspondante. Nos microbes se sont très bien développés en surface, mais en râclant ces milieux nous mavons encore qu'une quantité infime de matière. Alors, nous ne poursuivons pas davantage ces recherches, et nous essayons d'obtenir, dans de nouvelles expériences sur des cullures de coli, des diastases d'hydrocarbones, ces dernières élant mieux connues et en général plus faciles à déceler. |

En milieu liquide, nous agissons comme précédemment ; solution de peptone à 3 pour cent, dans 4 ballons de 500 cc3, où nous ajoutons 20 grammes de lactose dans deux, 20 grammes de glucose dans les deux autres, le dose moyenne de 40 grammes de Sucres par litre, est, en effet, la plus favorable pour obtenir les diastases de ces sucres chez les microorganismes capables d'en secrétér. Comme l’on sait depuis longtemps que les quantités de diastases sont limitées par les produits que secrètent les microbes dans les milieux,

nous ajoutons un peu de carbonate de chaux qui, en l’es- -pèce, neutralisera l'acidité en excès.

Au bout de quelques heures, la fermentation est déjà très active, comme le témoignent les nombreuses bulles gazeuses qui remplissent les ballons ; nous laissons ainsi 10 jours, et nous filtrons. Faisons, au sujet de cette filtration, une remarque intéressante ; malgré l'addition de carbonate, la réaction étail légèrement acide, et nous avons dit plus haut que M. Holderer avait prouvé qu’une diastase en solution neutre ou acide, était totalement ou presque retenue par la bougie de porcelaine. Mais, le même auteur, opérant avec une solulion de sucrase d’aspergillus niger, a montré qu'en additionnant de 10 pour tent d’albumine d'œuf, cette solution, la

sucrase traversait Ia bougie. « Il s’agit d’un phénomène d'affinité des micelles, des tcolloïdes diastasiques pour la porcelaine, c’est-à-dire d'une teinture. L’albumine se fixe sur la porcelaine et empêche ainsi la fixation de la diastase. » (Holderer). |

Pour mieux voir le rôle de cette addition d’albumine,

au cas où nous ‘frouverions des diastases, nous ne l’ajoutons que dans 2 de nos ballons, l’un de glucose, l’autre de lactose. Nous avons donc en définitive 4 filtrats, essayés à l’étuve, purs de tout microbe.

Les filtrats au lactose sont mis dans des tubes de lait, ceux au glucose dans des solutions de ce sucre à 40 pour cent. La coagulation du lait aurait été la preuve de la fermentation acide du lactose ; quant à celle du glucose, nous pouvions la suivre, en dosant chaque jour l'acidité des ballons additionnés de filtrat ou en faisant la recherche et même le dosage de l'alcool produit.

Tous les résultats ont été négatifs : pas plus avec un filtrat qu'avec l’autre, il n'y a eu coagulation d’un tube de lait en l'espace de 15 jours, et les doses de filtrat ont pourtant été jusqu'à 5cc. pour 10 cc3 de lait. Pour ce qui est de laci-

dité des ballons de glucose, dosée avec une solution décinormale de soude, elle n’a jamais différé de celle de la so-

EATLrS

lution témoin mise à l’étuve dans les mêmes conditions, et qui. elle, n'avait jamais reçu de filtrat ; nous croyons inutile de donner des chiffres qui ne feraient que confirmer ce résultat négatif.

La recherche de l'alcool par distillation au Salleron et réactions chimiques habituelles n’a pas été plus positive.

Il ne nous restait plus alors qu'à tenter l'essai de cultures sur milieu solide hydrocarboné, essai qui avait échoué pour la matière albuminoiïide. En nous servant de pomme de terre, nous savions que nous aurions d'abondantes cultures, pouvant être broyées et traitées ensuite convenablementi ; le coli bacille pousse en effet très bien sur pomme de terre et celle-ci est le milieu hydrocarboné par excellence, néanmoins, ce n'était plus un milieu chimiquement défini comme les précédents, car l'hydrocarbone est peutêtre utilisé à l’état de sucre par le microbe, mais existe dans le tubercule à l’état d’amidon. En plus, il v a des quantités notables d'azote ; aussi était-il plus difficile de dire, a priori, quelles diastases, à part l'amylase, pourraient être obtenues sur ce milieu.

20 tubes de pomme ‘de terre sont ensemencés et laissés 15 jours à l’étuve. Les cultures sont très épaisses et le ràclage permet de recueillir 30 grammes environ de masse microbienne ; nous traitons cette ‘masse par la méthode suivante qui a permis à Büchner et Meisenheimer d’extraire des ferments solubles chez des microorganismes du genre. «lactis aerogenes »: traitement par l’acétone, puis à l'éther : dessiccation dans le vide, broyage avec du sable et un peu d’eau. (Disons dès maintenant que, pour la commodité de nos expériences, nous n'avons pas fait notre dessicalion dans le vide, mais à l’étuve à 50 degrés, température qui n’est pas suffisante pour diminuer l'activité d'une diastase, mais qui permet d’atténuer celle des microbes). Ces auteurs n'ont pas filtré leur macération et l'ont directement ajoutée à une solulion de saccharose additionnée de craie; ils ont vu se former de l'acide lactique; de

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même, avec « l’acéti », ils ont eu de l’alcool. Comme preuve

) qu'il s'agissait bien de ferments solubles, ils ont fait des essais de culture avec les produits broyés, qui n’ont donné aucun résultat.

Nous agissons donc de même et (de notre propre initiative, d’ailleurs), nous négligeons la filtration employée dans nos expériences précédentes. Nous allons en voir la conséquence.

Notre macération de microbes est ajoutée à des tubes de lait, à des solutions de glucose et de lactose. Au bout de trois jours, coagulation du lait d’une part, acidité très nette. des solutions sucrées. Nous pensons être arrivé à un résultat, il ne nous reste plus qu'à en faire la preuve en faisant des essais de culture avec les produits de broyage. Ensemencés sur gélose, nous avons en 24 heures des colonies qui n'ont aucune des réactions morphologiques et biologiques du coli-bacille ; nous constatons au microscope, exclusivement du b. subtitis ; or, ensemençant ce subtilis dans des solutions de sucres (glucose et lactose), nous voyons les mêmes transformations que celles que nous avons pu attribuer un instant à des diastases ; le lait, qui n’avait pas coagulé en 48 heures avec ce microbe. C’est au bout de 4 jours. Nous ne pouvions donc affirmer aucun résultat précis, et il nous fallait avoir recours à la filtration pour nous débarrasser de ce subtilis.

L'expérience est reprise; de nouveaux tubes de pomme de terre sont ensemencés, les ‘cultures sont traitées comme précédemment, le liquide recueilli après broyage est filtré sous pression après addition d’albumine. Les essais sur le lait et les sucres sont restés complètement négatifs. Nous avons cherché aussi en vain l'existence d’une amylase qui aurait saccharifié des solutions d’empois d’'amidon que nous avions préparées.

Nous avons jugé bon de relater cette épreuve qui nous prouve une fois de plus la rigueur de la méthode à employer dans ces études.