TECHNIQUE DE DOSAGE MICROBIOLOGIQUE

En général, pour réaliser pratiquement un titrage microbiologique, il faut réunir diverses conditions, dont trois sont essentielles, à savoir premièrement:

— Choisir une souche microbienne incapable de synthétiser le facteur de croissance que l’on veut titrer. Il faut que cette souche, en plus de sa spécificité, soit stable (d’où la nécessité de l’entretenir dans des conditions telles qu’en proliférant, elle n’acquiert par mutation le pouvoir de synthétiser le facteur de croissance en question).

— La deuxième condition à réaliser est celle de la mise au point d'un milieu de base favorable. Logiquement, nous devrions chercher à obtenir un milieu de base contenant en concentration optimale, tous les éléments susceptibles d’influencer la croissance du germe choisi, en dehors de toutes traces du facteur à titrer, cela va sans dire. Ceci, pour s’assurer que toute stimulation ultérieure sera bien spécifiquement provoquée par l’addition du facteur à titrer.

Un tel milieu de culture serait très délicat à réaliser, exigeant alors l’apport de matériaux tels que les extraits de viande, de levure, les peptones et hydrolysats de caséine: toutes substances riches en facteurs de croissance, où il faudrait, au préalable, détruire celui que l’on se propose de titrer. Ainsi la meilleure solution, dans les cas où elle est possible, reste encore celle d'utiliser un milieu simple, svuthétique de préférence, et, en tout cas, chimiquement défini: d’où l’emploi indispensable de produits chimiques de très grande pureté. É

__ Enfin, en troisième lieu: autre condition essentielle à réaliser: la mise au point d’une méthode de mesure permettant l'évaluation quantitative de la réponse du microorganisme-test à des doses variables du facteur étudié.

Cette réponse du microorganisme peut être évaluée non seulement par celle du développement microbien, «mais aussi par l'évaluation d’une quelconque activité physiologique, telle que l’acidification, la réduction, l'intensité respiratoire» etc. (Sarrory et MEYER) (16).

Lors de nos essais, nous avons toujours mis en parallèle:

pole

taux de Vitamirre et développement de la Bactérie. A l'exception du titrage de la Pyridoxine, pour lequel nous avons évalué la réponse par pesée du mycélium de Neurospora sttophila (seul cas également où nous ayons employé un Chanipignon comme microorganisme-test), pour tous les autres titrages, nous avons mesuré le développement microbien par opacimétrie.

Réalisation pratique.

Le développement des germes étant proportionnel à ja concentration du métabolite essentiel à doser; il faut tout d’abord, par addition de quantités connues du facteur de croissance étudié au milieu synthétique approprié, réaliser une gamme de milieux à concentration croissante en ce facteur donné, pour établir une courbe étalon standard traduisant graphiquement l'intensité du développement.

En d'autres termes, il faut ensemencer le microorganisme-réactif dans le milieu de base auquel on a ajouté des quantités variables et connues du facteur à doser. On procède en dernier lieu à la mesure du développement microbien en rapport avec les taux vitaminiques, après une incubation dont les conditions (durée, température.) sont exactement déterminées.

Pour tous nos dosages, à l’exception de celui de la Pyridoxine pour lequel nous avons eu recours à des mesures pondérales, nous avons évalué l’intensité du développement microbien à l’aide d’un photocolorimètre:le Lumétron Colorimeter N° #02E, muni de filtres appropriés aux différentes vitamines.

On trace alors une courbe en portant en abcisses les quantités de Vitamines introduites, et, en ordonnées, les diverses valeurs correspondantes obtenues par mesure du trouble du milieu de culture.

Cette eourbe-étalon nous permettra, par simple lecture, de déterminer alors dans les mêmes conditions expérimentales, la teneur en facteur de croissance d’une préparation inconnue (ex.: Protéolysat) spécifique du microorganisme. Il est nécessaire, toutefois, de refaire, lors de chaque essai, une nouvelle courbe d'étalonnage, les conditions d'opération pouvant varier d’un essai à l’autre.

D'autre part, pour obtenir de bons résultats, il est nécessaire également de faire des dilutions convenables du produit à doser, afin d'obtenir pour celui-ci des valeurs se rapprochant de celles de la gamme-étalon, ce qui évite les causes d'erreurs dues aux interpolations.