DOSAGE DE LA THIAMINE DANS LE PROTEOLYSAT A

Passons en revue, rapidement, quelques-unes des méthodes préconisées pour le titrage microbiologique de la Thiamine.

En premier lieu: la méthode de SCHOPFER et JUNG, basée sur la croissance de Phycomyces blakesleeanus, proportionnelle à la quantité de Thiamine présente dans un milieu défini et dans certaines limites.

Les mesures se font par pesée du mycélium ou, d’après la méthode modifiée par BurLer et J. MEYER (22) en mesurant la longueur des hyphes.

Mentionnons encore les méthodes de WizLiams, MC MA- HAN et EaAkIN: celle de SCHULTZ, ATKIN et FREY (23). Toutes deux sont basées sur la croissance de Saccharomyces cereviside, mais elles ont l'inconvénient de nécessiter la préparation de milieux compliqués.

Ayant à notre disposition un excellent milieu Difco, deshydraté, nous avons adopté la technique récente de SARETT

et CHELDELIN (24). Cette dernière utilise comme microorganisme-réactif : Lactobacillus fermenti 36.

Milieu de base.

Sa composition, telle qu’elle est indiquée par les auteurs de la méthode est la suivante:

Peptone traitée par la Soudére10.0 5:

Acétate de soude ........::--.. 16,0 g.

Hydrolysat acide de Caséine avi-

a DB ES M PRO ER 2,0 g.

CCS CR RCE 20,0 g.

Chlorhydrate de Cystine ...... 0,1 g.

Chlorure de Sodium .......:-.: 5,0 g.

Adénine, Uracile et Guanine (de Chaque)n "tn, 0,01 g.

CNT AE ae

d-Pantothénate de Calcium ... 0,1 g.

RIDOL AVIN EME EEE ARE 0,1 g. AmRIUe MICONMIQUENT ELA NE 0,1 g.

Acide p-amino-benzoïque ..... OR:

PNTIdO SITE NE NS TA AE 0,1 g.

BIOMASSE Es ne 0,0004 mg.

ACT ATONAre RAR ETAPE te 0,0004 mg.

Solution minérale AE DEL SOLUTION CINE Ale BE PER E ACC:

Éaudistilléee sms" e 500 cc.

Les solutions minérales A et B ont été déjà mentionnées à propos du dosage de l’Acide folique, où nous avons donné Ieur composition exacte.

Nous voyons combien l'emploi du milieu Difco, tout prêt, facilita notre travail, tout en diminuant les sources d’erreurs quasi inévitables lors d’une telle préparation; effectivement, réservé au dosage microbiologique de la Thiamine, il renferme tous les facteurs nécessaires à la croissance du Lactobacillus fermenti 36, à l'exception de la Thiamine.

La réhydratation de ce milieu, désigné sous le terme: «Bacto-Thiamin-Assay-Medium>, se fait à raison, de 85 9. pour 1000 ce. d’eau distillée; on met en suspension et on porte à ébullition pendant 2 à 3 minutes: on obtient un liquide jaune pâle; les milieux employés pour l’Acide folique et le Pantothénate sont de teinte nettement plus foncée et rougetre.

Préparation de la solution étalon de Thiamine.

Les Laboratoires Difco indiquent qu'avec l'emploi d’un tel milieu, les doses les plus favorables pour obtenir des résultats corrects varient de 0,01 y à 0,05 y de Chlorhydrate de Thiamine par tube de 10 cc. de milieu: c’est pourquoi, nous avons fait une solution-étalon renfermant 0,01 y par ec.

Etablissement des séries d’essais.

Gamme étalon.

sine Re te 3. nes 6: 7.

| cc. ce M éc: Corp ce n|Mec: ec.

Milieu de base........ 5 DA OMR 5 5 5 5 SOIEONNÉtAIONERE EEE 0 0,5 1 2 3 4 5 HATANSEIÉ CREER 5 4,5 4 SN 2 1 0

ET AITAT =

Soit une gamme comprenant, par tube à essai, le premier tube servant de témoin, les doses de Thiamine suitvantes: 0,005 - 0,01 - 0,02 - 0,03 - 0,04 - 0,05 +.

Gamme échantillon à titrer.

Tube N° 4 2. 3. 4. 5.

Boucher tous les tubes et stériliser; la Thiamine étant très sensible à la chaleur, il faut disposer les tubes pendant 15 minutes à la vapeur fluente à 100°: une température supérieure risquant de provoquer une destruction possible de la Thiamine.

Préparation de l’inoculat.

L’émulsion bactérienne est préparée à partir de la souche de Lactobacillus fermenti conservée sur «Bacto-Micro-Assay- Culture-Agar», que l’on repique dans 10 ec. de Bouillon «Bacto-Micro-Inoculum»> et que l’on place à létuve à 37° pendant 16 à 18 heures avant l'heure approximative prévue pour l’ensemencement.

Après ce temps d’incubation, les bactéries de cette culture sur bouillon sont alors aseptiquement centrifugées; le liquide surnageant est décanté et on remet en suspension les cellules microbiennes qui forment le culot de centrifugation dans 10 cc. de soluté isotonique stérile. Cette suspension est encore diluée au 1/20 dans le soluté physiologique stérile: on a ainsi l’émulsion définitive qui doit être légèrement trouble. Une goutte de cette suspension microbienne, introduite de façon stérile, à l’aide d’une pipette de Pasteur, dans chaque tube, suffira pour que l’on obtienne, après incubation à 37° pendant 16 à 18 heures, un trouble de culture suffisant pour les mesures.

Il ne faut pas laisser plus longtemps les cultures à l’étuve, car, à partir de la 20° heure, Lactobacillus fermenti peut utiliser le Thiazol et la Pyrimidine, constituants de la molécule de Thiamine, ce qui fausserait considérablement les résultats: c’est pourquoi, -dès la période d’incubation achevée, il faut, sans tarder, retirer les cultures de l’étuve et les passer 30 minutes à la glacière pour arrêter la croissance, puis, procéder aux nresures dès que possible.

Thiamine

Valeurs numériques obtenues au lumétron.

0, 55 0, 01y cbey! 0, 03 0Éuy 005) Concentrations en y de thiamine

f V 4 7 pur

RATÉ CRE — mesures courbe étalon . — protéolysat

AQU =

Mesures.

Nous avons utilisé, dans le cas de la T'hiamine les filtres <Lumetron» Primary et Secondary B, et l’écran n° 4.

| Nous exprimons dans le tableau suivant les résultats ainsi obtenus:

ESéH0in "9, Solution vitaminique-test:

DH De) 23 DO US 070 DORA es 0037 == 694 = 9 — 604 DO 739 0 640 DOS Abe 0 67 8

Protéolysat à doser:

lcc-1Prot "pur:

He Pro 472:

04,9 SS À TeCCMETO AL SE =18,25-197—=,9,9 rec. Prot..t/10:

— 2060252 HiccrProt 100:

— croissance presque nulle.

Discussion des résultats. —— Conciusion.

Le tableau des mesures obtenues au Lumétron, nous indique que les valeurs numériques suivent bien l’ordre des concentrations en T'hiamine.

Une simple lecture nous montre que:

1 cc. de Protéolysat pur à 2% renferme approximativement 0,05 y de Thiamine, résultai appuyé par les chiffres qui traduisent la teneur en Thiamine de 1 cc. de Protéolysat au 1/2.

En effet, sa teneur est comprise entre 0,02 et 0,03 y. Le calcul nous donne:

56,5 + 60,4 116,9 — — 58,4 2 2 0,02 + 0,03 soit: —0,0252"

1 cc. de Protéolysat dilué au 1/2 contient: 0,025 y de Thiamine: résultats confirmés par la lecture de la courbe.

D’où nous sommes autorisés à conclure:

1 cc. de Protéolysat pur à 2% renferme 0,05 y de Thiamine.