DOSAGE DE LA VITAMINE PP DANS LE PROTEOLYSAT A

La Nicotinamide est un facteur essentiel à la croissance de certaines bactéries, parmi lesquelles nous citerons: Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Proteus morgani, Corynebacterium diphteriae, Lactobacillus arabinosus, etc.

Pour le titrage de cette Vitamine, nous aurions pu choisir par exemple, la méthode de SNELL et WRIGHT (28), basée sur la production d’Acide par Lactobacillus arabinosus, proportionnelle dans certaines conditions, à la concentration du milieu en Niacine;: mais la méthode de LWOFF et QUE- RIDO (29) nous a semblé préférable.

Cette technique est basée sur l'observation fondamentale de Fins (30) qui, en 1938, a montré que l'Amide nicotinique était le seul facteur de croissance indispensable, mais suffisant, pour Proteus vulgaris, jusque là cultivé sur des milieux complexes à base de Peptone.

C’est à la suite de cette observation que LWorr et Quérino étudièrent les réactions qualitatives et quantitatives de Proteus vulgaris à l'Acide nicotinique et établirent une méthode de dosage de la Vitamine PP, basée sur le développement de cette bactérie.

Cette méthode fut reprise en 1943 par M. MOREL O1: puis, à la Faculté de Pharmacie de Strasbourg par J.-C. Po- TN (32) en 1951, qui l’employa pour montrer la richesse de la Réductose en Vitamine PP.

Milieu de base.

C’est le milieu de FiLpEs, modifié par LWOFrF et QUÉRIDO: C’est un mélange, dans les proportions que nous indiquerons ultérieurement, de trois solutions préparées séparément.

SMS GS

Solution A.

Phosphate monopotassique (Merck) 4,5 g.

Sulfate :-d'Ammoniaque !. :..,....... O7 71, ChioruresdePotassiume 1" 7 0,50 g.

Suliate”deMagnéstum "5707 0,05 g.

On ajuste le PH à 7,5 au moyen de Lessive de soude et on stérilise pendant 20 minutes à 115°.

Solution B.

GIUCOSE RS RU ST NE RP TRE 30 g.

PAUL AIS THÉ CEE ERNEST El 109 cc.

Solution qu’il faut tyndalliser trois jours de suite, pendant une heure à 80°: la teneur en Glucose étant très élevée, une température supérieure risquerait de caraméliser la solution sucrée.

Solution C.

Solution de Citrate ferrique à 1 pour 1000, dans l’eau distillée.

Nous tyndallisons également cette dernière solution pour éviter la décomposition du sel ferrique.

Préparation du milieu final.

Nous réalisons le milieu définitif en ajoutant à 950 cc. de la solution A, 10 cc. de Solution B et 5 cc. de Solution C.

Il importe de soumettre un tube de ce mélange définitif à l’étuve à 37° pour vérifier qu'il ne cultive pas et que, par conséquent, la stérilité de l’opération a été sauvegardée.

Un tel milieu permet d'obtenir un bon développement du Proteus, sans formation de voile ni de grumeaux. De composition parfaitement définie, très simple à préparer et limpide, il ne présente aucune coloration susceptible de gêner les mesures.

Préparation de la Solution de Vitamine PP.

Nous verrons dans le paragraphe suivant que, dans le but d'obtenir 10 cc. de milieu ensemencé dans chaque tube à essais, nous avons ajouté 0,20 cc. de solution de Vitamine PP et 0,10 cc. d’émulsion bactérienne à 9,70 cc. de milieu de base.

En conséquence, pour simplifier les calculs, nous avons préparé une solution-étalon à 0,010 g. pour 1.000 de Vitamine PP, soit à une concentration de 10 y par cc. solution que l’on tyndallise 3 jours de suite à 80°, pendant une heure.

SRE

Mode opératoire.

Nous avons réalisé toutes nos cultures dans des tubes } QC 1 N € 2» 71 LL à ‘ x : :

à essais de 25 cc. environ, faisant en sorte d’obtenir toujours 10 cc. lors de la mise en incubation.

À noter qu'il eût été préférable, comme le préconisent M. Welsch et M. Morel, d'employer des flacons d’Erlenmeyer: nous aurions pu ainsi, peut-être, obtenir des résultats plus réguliers, en raison d’une meilleure aération des cultures.

Nous avons opéré comme suit:

Il fallait, en premier lieu, obtenir une souche de Proteus X 19 carencée en Vitamine PP; nous avons préparé une émulsion de germes: après avoir réensemencé la souche sur une gélose inclinée pour la conserver, on râcle la culture primitive et on l’émulsionne dans du soluté physivlogique stérile, jusqu’à obtention d’un trouble convenable. À partir de cette émulsion, on essaie d’adapter la bactérie au milieu synthétique, de concentration 2 X 107% en Amide nicotinique:

Dans toute une série de tubes, nous avons introduit:

— 9,70 cc. de milieu synthétique, -— 0,20 cc. de la solution-étalon à 0,01 g. %,

(ce qui correspond bien à une concentration en Vitamine PP de 2 X 105% pour les 10 cc. de milieu),

__ et 0,10 ce. d’émulsion bactérienne dans un premier tube.

Puis, les jours suivants, nous avons opéré des repiquages, prélevant chaque fois 0,1 ce. du tube ensemencé la veille pour ensemencer le suivant. Les cultures sont placées à létuve AO

En effet, dans le dosage de la Vitamine PP, toutes nos cultures ont poussé à une température d’incubation de 28°, car, selon M. More, le Proteus nécessiterait beaucoup plus de Nicotinamide à 37°, ce qu’elle qualifie «d'augmentation héréditaire du besoin d’un organisme pour une Vitamine».

Au bout de quelques jours, la croissance, faible au premier repiquage, est redevenue normale: la souche est donc suffisamment habituée à ce milieu de concentration 2 X 10 en Amide nicotinique. Nous la repiquons alors sur un milieu dont la concentration en Vitamine PP permet la survie, mais non le développement du Proteus; pour ce faire, à partir de la souche adaptée au milieu synthétique 2 X 10—$, nous avons procédé à des repiquages en série sur le milieu synthétique, mais alors de concentration Del Pen Vitamine lPl:

DRASS NES

Dans les tubes à essais, nous introduisons:

— toujours 9,70 cc. de milieu de base, — 0,02 cc. de solution-étalon de Vitamine PP à 0,01 g. %,

(au lieu de 0,20 cc. — concentration voulue 10 fois plus faible), — 0,18 cc. d’eau distillée, pour avoir un volume final de 10 cc.,

— 0,10 cc. de la culture de la veille.

Après 3 à 5 repiquages successifs, l'excès de facteur de croissance apporté par l’ensemencement était éliminé et dans les tubes nous n'avions plus qu’un développement nul ou négligeable: nous étions alors en présence d’une souche carencée en Vitamine PP; c’est à l’aide d’une telle souche, venant d’épuiser l’Acide nicotinique du milieu, durant 24 h. à 28°, que nous avons ensemencé nos séries de tubes de milieu.

Nous avons fait de nombreux essais, faisant varier les concentrations de la Vitamine PP en resserrant peu à peu les dilutions de Protéolysat de façon à obtenir des troubles de culture d’intensités voisines.

Dans un dernier essai, nous avons établi les gammes suivantes:

Tube N° al a | Ex Milieu de base ........ | 9,7 | 9,7 | 9,7 Solution étalon à 0,01%, | 0,02 0,2 0,2 HAURISCLUlÉ EME RE EN E 0,18 | 0 | 0,1 SOUCILE EN PRE P Re MN AAUEe | 0,1 | 0,1 | non ensemencé

Gamme de Protéolysat.

Tube N° 4 5 | 6. T 8 ec Ce ec. ce cc Milieu de base ........ | 9,7 9,7 GET 9,7 9,7 Dilution du Protéolysat OITCONANE APTE SERRE 210 1/50 1/80 1/100 1/200 AUS ULIÉ MERE | 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Emulsion bactérienne ..! 0,1 0,1 DEEE ON 0,1

Au bout de 24 h. d’incubation à 28°, nous avons fait les observations suivantes:

Dans le tube N° 1: survie, pas de croissance (2 X 10). Dans le tube N° 2: croissance normale (2 X 105). Dans le tube N° 3: tube témoin; limpide.

Dans les tubes N° 4 et 5: trouble très intense.

Dans le tube N° 6: trouble moyen.

Dans les tubes N° 7 et 8: croissance très légère.

Nous avons alors comparé la turbidité des tubes au Lumétron en employant le filtre 470 mu et l’écran N° 4.

Vitamine PP

btenues au lumétron [ei]

numériques o

Valeurs

1/0 150 Vgoi 1/00 2itutions protéolysat 1/60 9 x10-° (solution vitamine PP)

—Icoutbe — mesures du protéolysat . — mesures solution vitamine PP