DOSAGE DE L’ACIDE PARA-AMINOBENZOIQUE
L'Acide para-aminobenzoique joue non seulement le rôle d’une Vitamine chez les animaux supérieurs, mais sa spécificité, en tant que facteur de croissance pour divers microorganismes, a été bien établie: on sait qu’il est indispensable à Clostridium acetobulylicum, Streptobacterium plantarum, Acetobacter suboxydans, ainsi qu’à divers mutants de Neurospora crassa, obtenus par traitement aux rayons NO ultra-violets.
De ce fait, plusieurs méthodes basées sur la croissance de l’un ou de l’autre de ces microorganismes-tests ont été mises au point; citons: celle de LanpY et DickEN (33), employant comme souche Acetobacter suboxydans; la méthode de Lewis (34), qui utilise Lactobacillus arabinosus; celle de THompPson, ISBELL et MirrcHELLz (35), basée sur la mesure du diamètre d’une colonie de Neurospora crassa.
Nous avons employé la méthode de NATTI, TABONE et MOUSSET (36), bien différente des précédentes, appelée encore: méthode des Antisulfamides. En voici le principe, tel que l’énonce M. WELSCH:
«On mesure le pouvoir neutralisant d’une quantité fixe de la substance antisulfamide à titrer vis-à-vis de quantités croissantes de Para-amino-phényl-sulfamide, Proteus vulgaris X 19 en milieu synthétique servant d’organisme-test>.
L'action antisulfamide de certains produits organiques, peptones, extraits de levure et de bactéries, est connue grâce aux travaux de SraMP et GREEN.
Les auteurs anglais Woops et Fizpes (37) observèrent en 1940 que l’Acide para-aminobenzoique exerçait une action inhibitrice sur le pouvoir bactériostatique des Sulfamides.
Déjà en 1937, MAC Ixrosu et Wuirgy (38) affirmaient:
«Les médicaments sulfamidés ne sont pas simplement des germicides. Ils agissent vraisemblablement par neutralisation de quelque fonction métabolique de quelque activité enzymatique».
À la suite de leurs recherches sur le mode d’action du 1162 F et sur l’antagonisme exercé vis-à-vis de cette substance par divers extraits microbiens, FILDES (39) et ses collaborateurs énonçaient: «le sulfamide prend, dans les microorganismes, la place d’un métabolite essentiel, c’est-à-dire d’une substance indispensable à la multiplication».
Cette substance, ils l'ont identifiée à l’'Acide para-aminobenzoïque; ils montrèrent que cet acide, à concentration 5 à 20.000 fois inférieure à celle du Sulfamide, supprimait son activité inhibitrice sur le développement du Streptocoque et du Colibacille.
On a prouvé également son effet inhibiteur à faibles. quantités sur la toxicité des Sulfonamides vis-à-vis des Staphylocoques, Pneumocoques, Gonocoques et Bactéries lactiques.
Le 1162 F étudié en raison de son analogie de constitution avec la Nicotinamide
C—SO0NH?
HC cH HC CH C-NH
Acide para-amino - - phényl -sulfamide
est, en milieu synthétique, dépourvu d’action inhibitrice sur les bactéries Escherichia coli et Proteus vulgaris.
Selon FILDES, «l’action bactériostatique des Sulfonamides est due à leur similarité de structure avec le métabolite en question».
MM. Nrrn et FAGUET (40) déclarent: «il est connu que Paddition d’'Acide p-aäminobenzoïque, en concentration convenable, à une culture bloquée par la présence d'un Sulfamide, est suivie de la reprise immédiate d’une croissance notmale où à peine ralentie».
Lworr.(41) prouve aussi que cette action favorable est encore possible sur des cultures restées latentes pendant plusieurs semaines.
FRS Qo ee
Milieu de base.
Il est peu différent de celui que nous avons employé pour le titrage de la Vitamine PP. Il s’en distingue essentiellement par le fait qu’il contient de l’Amide nicotinique, facteur indispensable, comme nous l’avons déjà dit, à la croissance du Proteus.
On prépare séparément les 3 solutions suivantes:
Solution À.
Sulfate d’Ammoniaque .......... 0,75 £.
Phosphate monopotassique ...... 13,60 g.
Chlorure de Potassium -......... 0,50 g.
Sulfate de Magnésium, 7 H:0 ... 0,05 g.
Acide MHICOHIMIQUEML LE SARL 0,01 g.
Fahidistuléé OS PAST ir re 1.000 cc.
ajuster le PH à 7,5 Solution B.
Crete ique saine. tou LORS:
Chlorureide Calciume ne st LOS RauvdistilléeN OS Parure L.000/cc.
Solution C.
RC IUCOS CANIN AE Re an re 300 g.
PanrdistiléerO SPA LEE eur, 1.000 cc.
On stérilise La première Solution (A) pendant 15 minutes à 115°; par contre, on tyndallise la deuxième et la troisième pendant une heure à 80°, trois jours consécutifs.
Le milieu complet est fait d’un mélange de:
Une partie de la Solution B et quatre parties de la Solution C sont ajoutées à la Solution À dans la proportion de 4 ec du mélange B + C pour 9,6 ce. de A.
Préparation des solutions étalon d’Acide P.A.B. et de Sulfamide.
Nous avons relevé dans les Annales de l'Institut Pasteur (41 bis) que: «I molécule d’Acide para-aminobenzoïque débloque 2.000 molécules de Sulfamide dans le cas du Streptocoque, 1.000 dans celui du Colibacille et 500 pour le Proteus.
A noter que, dans ces conditions, pour le Proteus et le Colibacille, le rapport Sulfamide/Acide para-aminobenzoïque reste constant; en d’autres termes, si on additionne les milieux d’une quantité 10 fois supérieure de Sulfamide,
SR 1 Re
on obtiendra des résultats analogues avec 10 fois plus d’Acide para-aminobenzoïque, différence avec le Méningocoque dont l’action antisulfamide ne se manifeste que si les concentrations de Sulfamide sont faibles, et, des concentrations de 1/1.000 à 1/2.000 restent insensibles à des quantités très élevées d'Acide p-aminobenzoïque.
Nous avons réalisé une première solution d’Acide p-aminobenzoïique à 0,0006 g. % et une solution de Sulfamide 900 fois plus forte, soit à 0,3 8. Le, étant donné qu’une molécule d’Acide p-aminobenzoïque neutralise 500 molécules de Para-amino-phényl-sulfamide.
La solution d'Acide para-aminobenzoïque s'étant révélée trop faible, nous l’avons portée alors au taux de 0,003 g. Lo.
Les résultats étant toujours décevants, nous avons établi des solutions d’après les poids moléculaires:
PM Acide P-AB — 137.
PM Acide P-A-Phényl-Sulfamide — 172.
137 gr. d’Acide para-aminobenzoïque devant neutraliser 172 X 500 g. de Sulfamide, 1 mmg. de P-AB correspond donc à 0,6 g. de Sulfamide.
Par simplification, nous avons, en réalité, réalisé une solution d’Acide p-aminobenzoïque 600 fois moins concentrée (au lieu de 500) que celle de Sulfamide, soit:
1/600 pour une Soon de Sulfamide à 1%,
ce qui correspond à une solution à 0,0016 grammes d'Acide para-aminobenzoïque pour 100 ce. d'Eau distillée.
Et nous avons préparé 3 solutions différentes de Sulfamide :
1° une solution mère à 1%, soit à 10.000 YaDari ce
2° une solution à 1/1000, soit à 1.000 y par cc. obtenue par simple dilution au 1/10 de la précédente.
J° une troisième solution à 1/10.000, renfermant donc 100 y de Sulfamide par cc. obtenue facilement par dilution au 1/10 de la solution 2.
Ces différentes solutions ont été réalisées pour nous permettre d'établir plus facilement des gammes d'essais très étendues et surtout d'opérer toujours dans les mêmes conditions de dilution, comme nous le verrons dans le prochain paragraphe.
LT TRS ce
Technique.
Nous avons, en premier lieu, déterminé à quel taux de Sulfamide la souche cultivée sur le milieu de base ne poussait plus.
Cette souche: Proteus X 19, était repiquée toutes les 24 h. sur le milieu de base qui lui permettait une croissance normale en raison de l’Amide nicotinique qu’il renfermait.
Pour tous nos essais, l’incubation se faisait à 37°.
Poursdéterminer la dose de Sulfamide limitant la croissance de la souche, nous avons procédé de cette façon:
Dans des séries de tubes à essais contenant 10 ec. de milieu de base complet, nous introduisons une quantité de solution de Sulfamide de concentration variable et toujours de 1 cc. au maximum; puis, nous ensemençons à l’aide de 0,1 cc. de la souche repiquée la veille. Ce qui porte Île volume final de chaque tube à 11,1 cc.
C’est en effet à cette occasion qu’intervenaient nos trois solutions différentes de Sulfamide, ainsi:
Pour introduire dans un tube 10.000 y de Sulfamide, il suffisait d'ajouter 1 cc. de la première solution à 1%.
Un essai avec 1.000 y était pratiqué au moyen de 1 cc. de solution de Sulfamide, mais cette fois-ci de la deuxième.
Pour obtenir la concentration de 5.000 y, par exemple, nous mettions dans le tube à essai 0,5 cc. de la solution I de Sulfamide (à 10.000 y/ec.) et 0,5 cc. d’eau distillée.
Bref, la quantité de Sulfamide ajoutée se ramenait toujours à un volume de 1 cc.
Nous sommes ainsi parvenus, après bien des tâtonnements, à déterminer pour quelle dose de Sulfamide la croissance de la souche était inhibée:
La souche qui pousse encore en présence de 1.770 y de Sulfamide, ne se développe plus avec 1.800 y, soit en présence de 0,895 cc. d’une solution à 2.000 y par cc.
Titrage proprement dit.
Nous utilisons deux séries de tubes, contenant 10 cc. de milieu de base et des concentrations de Para-amino-phénylsulfamide croissantes, sous un volume toujours ajusté à 1 ce.; dans l’une de ces séries, nous introduisons une quantité fixe d'Acide para-aminobenzoique, et, dans l’autre, une quantité fixe de Protéolysat de dilution convenable: le problème se
moi
ramenant à trouver la dose de Sulfamide capable de neutraliser telle quantité fixe et connue de solution-étalon d'Acide para-aminobenzoïque et une quantité égale en ce. de Protéolysat, de dilution telle que la croissance obtenue soit la même dans les deux cas.
Nous avons fait un essai préalable qui s'établit comme suit:
Tube N° | ; C s 2 : o Le L | à SE = Milieutde, Dase ETC NM RE TAIUERE | 10 10 PHTO 10 10 Solution de Sulfamide à 1% ...... DOE LAN NET RE Solution-de? P'AÏP AS Me AE UNE 2 0 0 0 0 Protéolysat 2% dilué au 1/10 ...... | 0 0 O1 0,2 0,5 PAU CIS RE A UE | 0 2 1LOMAVERSTI I SaTS
Le tube 2 sert de Témoin.
Cet essai approximatif nous a montré qu’en présence de 10.000 y de Sulfamide, la croissance était positive dans les tubes 1 et 5, ce qui nous autorisait à conclure que 10.000 y ne parvenaient pas à neutraliser l’Acide p-aminobenzoïque contenu dans 2 cc. de solution-étalon à 0,0016%, ni celle contenue dans une quantité supérieure à 0,5 ec. de Protéolysat à 2%, dilué au 1/10. :
Nous avons cherché à opérer avec des quantités croissantes de Suifamide, supérieures à 1.785 y, concentration qui ne permet plus la croissance de la souche sur le milieu de base, afin d’être sûr que le trouble obtenu ultérieurement était dû uniquement à la quantité de Vitamine ajoutée, et non faussé (disons augmenté), par celui propre à la croissance de la souche qui, nous l’avons vu, est appréciable quand le milieu n’est pas neutralisé par un minimum de 1.785 y de solution sulfamidée.
D'autre part, les concentrations de Sulfamide croissantes que nous allions faire intervenir allant être forcément comprises entre 1.785 y et 10.000 y au grand maximum, il était évident qu'il fallait employer comme doses constantes dAcide p-aminobenzoïque et de Protéolysat au 1/10 des quantités bien inférieures à 2 cc. de solution-étalon pour Pune et 0,5 ce de Protéolysat 1/10, pour l’autre, puisque nous avons vu précédemment que 10.000 y ne parvenaient pas à les compenser.
