CULTURES SUR LES MILIEUX USUELS

J'ai cultivé B. chlororaphis sur trois catégories de milieux :

10 Les milieux usuels destinés à mettre en évidence certaines propriétés biologiques du Microbe;

20 Des milieux spéciaux permettant d’étudier l’action chimique de la Bactérie sur un élément déterminé;

30 Des milieux spécifiques (milieux synthétiques) destinés à exalter les fonctions fluorescigène et chromogène.

Gélatine - peptone-glucose- bouillon (gélatme : 10%; peptone 4% ; glucose : 1%). — La réaction est neutre ou alcaline (4 déeigrammes de soude par litre).

La température est celle de la chambre.

A) En plaques. — Cultivé sur plaque de gélatine, B. chlororaphis se développe assez rapidement et, au bout de trente-six

heures, on voit apparaître des colonies grisâtres par transparence, à peine visibles à l’œil nu. Après quarante-huit heures, ces colonies sont rondes, visqueuses, grisâtres (blanc-jaunâtre à 50 diamètres). Elles peuvent être transparentes, brillantes, et leurs bords sont fortement lobés et à incisures profondes. On peut observer, vers le troisième jour, de petites cupules incolores avec dépôt blane, jaunâtre au centre. Leur diamètre est de { à 2 millimètres, mais il va en augmentant et le cinquième jour il atteint 1 à 2 centimètres. À ce moment, les cupules sont circulaires, à bords finement dentelés, transparentes, et parcourues par des lignes ramifiées allant du centre à la périphérie. Avec le temps, les colonies s’accroissent rapidement, deviennent irrégulières et donnent un liquide quelquefois jaunâtre, mais plus souvent incolore tenant en suspension des flocons de couleur jaunâtre ou jaune citron.

Une seule colonie peut liquéfier la gélatine d’une boîte de Pétri en dix à douze jours. Le produit de liquéfaction est alcalin et doué d’une odeur caractéristique. La culture n’est pas, en général, fluorescente; cependant, la première que j'ai obtenue en partant de l’eau était entourée d’une couronne fluorescente. Le fond de la boîte est quelquefois tapissé d’un enduit vert ou vert noir. Les cristaux apparaissent à une époque variable. Dans quelques cas, j’ai pu les observer le quatrième jour, d’autres fois, le dixième ou le quinzième jour seulement. Vertes au début, les formes cristallines jaunissent à mesure que la culture vieillit.

B) En piqûre. — Ensemencé par piqûre dans un cylindre de gélatine, B. chlororaphis détermine, vers la quinzième heure, la formation, à la surface du milieu, d’une petite cupule dont la partie supérieure est occupée par de Pair et le fond tapissé par un dépôt blanchâtre. Puis, la cupule s'accroît beaucoup plus rapidement dans le sens diamétral qu’en profondeur, et au bout de quarante-huit heures, la liquéfaction a atteint les parois du tube. La gélatine se liquéfie sur une hauteur de 6 à 8 millimètres en donnant un liquide trouble présentant un voile très mince à et un dépôt blanchâtre au fond.

La liquéfaction continue par tranches transversales, le voile

se développe de plus en plus et le trouble se localise dans la partie supérieure du liquide.

Vers le cinquième jour, le liquide se teint en jaune et la partie trouble est réduite à quelques millimètres de hauteur; au fond, sur le dépôt blanchâtre ou jaunâtre, apparaissent les cristaux verts.

La liquéfaction atteint rapidement les trois quarts du tube, puis elle se ralentit et au bout d’un temps variable, la gélatine est complètement transformée en un liquide glaireux, alcalin et odorant.

La culture est rarement fluorescente et, à son aspect, il serait impossible de reconnaître sûrement le Bacille si les cristaux faisaient défaut.

Gélose-peptone-glucose-bouillon (Gélose 2%; peptone 1 %; glucose 1 %).

En plaques. — Bacillus chlororaphis cultivé sur plaque de gélose offre des colonies d’aspect divers que l’on peut ramener à quatre types :

Premier type : On obtient le plus souvent des colonies rondes, plates ou légèrement bombées, visqueuses, aux bords ondulés, de coloration blanc grisâtre avec cristaux au centre.

Deuxième type : Plus rarement, on trouve des colonies à peu près semblables aux précédentes, mais présentant en outre une auréole verte, fluorescente. Les cristaux sont moins nombreux que dans les premières.

Troisième type : On remarque assez souvent des colonies à centre jaune d’or ou jaune orangé et dont la partie externe est transparente. Les cristaux sont peu abondants.

Quatrième type : Enfin, on observe des colonies rondes, bleutées, brillantes, transparentes, aux bords très découpés et à surface plissée. Au centre et un peu excentriquement, on trouve la colonie primitive avec de magnifiques cristaux verts. Cette colonie n’adhère que très peu à la gélose et s’enlève très aisément d’une seule pièce. Il semble que ces colonies soient beaucoup plus abondantes sur les vieilles géloses ou si, utilisant des géloses frai-

ches, on n’évite pas l’évaporation durant le séjour des cultures à l’étuve.

L'examen des différents types de cultures montre des organismes ayant sensiblement mêmes caractères morphologiques, les modifications de formes sont si peu caractéristiques que, sur une préparation, il est impossible de reconnaître sur quelle colonie le Bacille a été prélevé.

Quant à la fonction chromogène, l’ensemencement en milieu synthétique type ne montre pas de grandes différences, le premier et le quatrième type donnent en général une bien plus belle production de cristaux, le troisième donne des cultures plus jaunes et avec le deuxième, la fluorescence est plus marquée. Je n’ai pas réussi à fixer ces différents types.

Enfin, notons seulement, pour l'instant, que des colonies de tous types peuvent très fréquemment ne pas présenter de cristaux, nous aurons l’occasion de revenir sur ce fait.

Gélose asparagine. — La gélose peptonée glucosée que nous venons d'étudier convient assez mal à la production de la chlororaphine. J’ai cherché à réaliser une gélose permettant une formation plus abondante de cristaux et, après des tâtonnements, je me suis arrêté au milieu de composition suivante :

Parties BOUNOR RL MEN AMAR RE 0) PÉRIONC SET HAE SRIR SAS LITRES. 1 GUGOSET MS LEE ER 1 CHEVROLET 0,5 ABDATALINE. UT TER MRENNOPARERrT EE 0,3

Après neutralisation à la phénolphtaléine, on ajoute 08,050 à 08,090 de soude. On stérilise à 1200 C., la gélose brunit. Ce sont les géloses colorées qui donnent les meilleurs résultats.

Les géloses de préparation ancienne, qui se sont concentrées par évaporation, pour être utilisées doivent être additionnées d'eau et stérilisées ensuite. Je ferai remarquer toutefois que des passages successifs à l’autoclave ne doivent pas être redoutés, le milieu ne faisant que se bonifier,

C’est à cette gélose que Je fais appel pour maintenir à peu près constant le pouvoir chromogène de mes cultures.

Tubes de gélose inclinée. — L’ensemencement par stries de B. chlororaphis sur tube de gélose asparagine (à 250-300 C.) montre des cultures visqueuses, grisâtres, plus ou moins transparentes, et gagnant rapidement toute la surface inclinée. Les cristaux apparaissent parfois dès le deuxième jour; ils débutent, en général, dans l’eau de condensation, puis, envahissent peu à peu la surface inclinée en formant tantôt quelques plages, tantôt de nombreuses petites taches vertes jaunissant à mesure que la culture vieillit.

Pomme de terre glycérinée (température 250-300 C.). — Sur pomme de terre, la Bactérie forme d’abord un enduit visqueux, glacé, variable avec l’âge et la variété de la pomme de terre. La culture est le plus souvent jaune citron, plus rarement jaune brun ou orange. Les points verts apparaissent après quatre ou cinq jours de culture. Ils constituent, au début, des îlots ou des plaques qui peuvent, par multiplication, recouvrir en tout ou partie l’enduit jaune. Parfois, les cristaux se forment au-dessous de la couche microbienne et paraissent gris-bleu alors qu’en réalité ils sont d’un beau vert; on peut s’en rendre compte en enlevant le mince enduit qui les recouvre. Le coton glycériné qui supporte la pomme de terre se colore généralement en jaune et est fréquemment envahi par la chlororaphine. Les cultures vieillissant, les cristaux jaunissent et l’enduit se décolore tout en restant très luisant, rarement la pomme de terre devient brunâtre.

Certaines vieilles cultures ont une odeur très nette d'acide cyanhydrique et le papier au sulfate de cuivre et au gaïac donne une coloration bleue très intense; les quantités extrêmement faibles de corps odorant ne permettent pas une identification rigoureuse.

Les pommes de terre glycérinées constituent un très bon milieu pour la conservation de la Bactérie.

Dahlia. —— Le développement du Bacille varie suivant le tuber-

cule de dahlia utilisé, généralement la culture est blanc grisâtre avec de nombreux cristaux. Le coton supportant le dahlia présente une coloration allant du jaune pâle au jaune citron et montre souvent des points verts. Fréquemment, les cristaux se développent au-dessous de l’enduit microbien et donnent à la culture un aspect gris-bleu; un simple grattage suffit à les mettre en évidence. Si on effectue une série de sections sur une culture présentant des cristaux, on aperçoit, par transparence, à l'intérieur du tubercule, des taches verdâtres constituées par des amas cristallins verts.

Je n’ai jamais observé la coloration vert bleuâtre du tubercule signalée par GUIGNARD et SAUVAGEAU.

Bouillon simple. Bouillon peptoné. Bouillon peptoné glucosé. Solution de peptone. — Les cultures de B. chlororaphis dans tous les milieux peptonés présentent des caractères très voisins; elles ne diffèrent généralement entre elles que par un développement, une fluorescence et une production de cristaux plus ou moins intenses.

À 370 C. le trouble peut être sensible dès la septième heure. A 309 C., au bout de dix-huit à vingt heures, il atteint 1 centimètre de hauteur environ à la partie supérieure du tube de culture; le reste du liquide est limpide. Vers la vingt-quatrième heure, le trouble, plus intense, s’est propagé sur une plus grande longueur et gagne ensuite rapidement tout le tube, la culture présente un voile à la surface et est légèrement fluorescente.

Les cristaux apparaissent vers le troisième ou le quatrième jour; la fluorescence disparait généralement au moment de leur formation et réapparaît souvent ensuite.

D'autre part, les cultures qui donnent peu ou pas de chlororaphine sont très fluorescentes, tandis que celles qui donnent des cristaux très abondants le sont peu ou même ne le sont pas du tout. Je dois ajouter que la réaction du milieu est étrangère à ce phénomène. Les cultures, généralement alcalines, ont une odeur caractéristique rappelant celle de la coumarine. En vieilhssant, elles deviennent visqueuses, glaireuses et leur filtration est extrêmement pénible,

Leur viscosité est due à des substances albuminoïdes que l’on peut précipiter par la chaleur, l’acide acétique, le sulfate d’ammoniaque.

Dès que la végétation est arrêtée, les cristaux jaunissent plus ou moins rapidement.

Le bouillon simple est un assez mauvais milieu ne donnant que peu ou pas de chlororaphine. Le bouillon peptoné lui est supérieur et l'addition de glucose, de glycérine favorise la production de la chlororaphine. Les solutions de peptone à 2% se comportent sensiblement comme le bouillon peptoné correspondant.

Les peptones Defresne, Chenal et Douilhet favorisent plus particulièrement la fluorescence tandis que les peptones Chapoteaut augmentent la production des cristaux.

Il est à remarquer que les peptones suffisent au Microbe comme source d'aliments azoté, carboné et minéraux pour l’édification des cristaux, et ce fait servira à expliquer leur production dans le lait.

En bouillon peptoné, la Bactérie perd rapidement la propriété de donner des cristaux. À chaque passage, l'intensité de leur production diminue et finalement on obtient des cultures fluorescentes ne donnant plus de chlororaphine. Ces dernières présentent souvent un voile plissé et rappellent les cultures de B. fluorescens mesentericus (TATAROFF 1891). Cette diminution de la fonction chromogène montre la nécessité de faire des passages constants sur gélose ou gélatine et de choisir avec soin les colonies présentant les plus beaux cristaux. Je ferai remarquer à ce sujet que l’on est frappé par le nombre considérable de colonies qui ne présentent pas de cristaux et que, d’autre part, des colonies à magnifiques aiguilles vertes reportées même en entier sur bouillon peptoné ne donnent pas toujours de la chlororaphine. Cétte observation tend déjà à démontrer que toutes les cellules ne sont pas également aptes à la production de la matière chromogène.

Le fait suivant conduit à la même conclusion.

Une culture récemment isolée présentant de nombreux eristaux est ensemencée dans 100 ballons de milieu peptoné. On

constate que la fonction chromogène est loin de présenter dans tous la même intensité. La quantité de chlororaphine produite dans chacun des vases ensemencés est très variable et souvent elle est nulle.

On comprend aisément, par suite, que cette espèce chromogène n’ait pas suscité de plus nombreux travaux et que THiry (1900) l'ait considérée comme perdant rapidement la propriété de donner des cristaux.

Conelusions. — La production des cristaux est donc un meilleur caractère que la forme pour la diagnose de l'espèce à la condition que la culture soit effectuée dans un milieu convenable.