CO OH

Le groupement acide aminé caractérisé par R—CH—NH° mis en présence de l’aldéhyde formique H—CHO produit la réaction suivante : R—CH—N—CH? + H°0; nous avons donc une

COOH combinaison où seule la fonction acide persiste; en présence de phtaléine du phénol, nous pourrons donc facilement caractériser et doser par un simple titrage au moyen de la Soude N/10 cette acidité qui nous donnera par la quantité d’acides aminés produits l’activité de la diastase. I//action de la trypsine n’étant pas gênée par la présence de traces de soude la production d’acides aminés est continuelle et peut être constatée au jour le jour par de nouveaux titrages.

Mode opératoire. — 20 ec. de liquide à examiner renfermant I gr. d’ovalbumine sont mis en présence de soude décinormale avec la phtaléine du phénol comme indicateur; la quantité de soude employée pour faire virer l'indicateur représente les acides libres. Après le virage on ajoute 10 cc. de formol exactement neutralisé au préalable; la mise en évidence de la fonction acide des acides aminés par le bloquage de la fonction amine se produit et la nouvelle quantité de soude N /10 nécessaire au virage donne les acides

(1) SÉRENSEN. C. R. Lab. Carlsberg VII, I (1907).

= 4 — aminés totaux. Les acides aminés totaux diminués des acides totaux préexistants représentent les acides aminés produits par l’ac-

tion diastasique de la trypsine sur l’ovalbumine.

Tableau donnant les résultats :

RO 1,7 2,1 3,048,R413:0413,0 4 0,07. 4 HES=UTS T NaCIl 2% 3,5 4,5 14,8 15,0 15;x |1,0 | 1,3 | 1,5 | 1,6 RNaCI]" 16 4,3 |4,5 | 4,62] 4,66! 4,66] 0,2 | 0,3210,33] 0,33

Les courbes suivantes dont les abscisses représentent les heures des dosages et les ordonnées les ce. de soude N/10 employés expriment l’ensemble de ces résultats. (Fig. 24).

cm3 de M0 Wo employe pour saturer des ac? es amines produit du dedoublemenE de Tor. d'Üralhumine per ’ ur ce les ET

Lo TÔ RO

45 T'NaŸe

RNatl

\ SR apres: Q# 3h 64 gh 124 d'xtron

Tryps 2ne; #yodiaslase:

Nous voyons, en comparant les résultats obtenus pour les différentes diastases considérées, une analogie frappante: nous mentionnerons ici que ces résultats sont en parfait accord avec ceux obtenus par SCHNEIDER (CO? produit par les levures) et ceux de ZELLER (1) (même sujet). Nous nous dispenserons de donner à

(1) H. ZELLER. Wirkung von Arzneimittel und Strahlen auf Hefe. Strahlentherapie B. XXIII, H. 2, s 336.

présent une explication de ces phénomènes auxquels nous reviendrons plus tard, après avoir exposé nos recherches sur les endodiastases. |

Endodiastases. — Pour l’obtention des endodiastases, c’est-àdire les ferments qui ne passent pas à travers la membrane cellulaire et dont l’extraction nécessite des artifices, plusieurs procédés s’offraient à nous; nous mentionnerons ici celui employé par BUCHNER (broyage avec du kieselguhr) et celui employé par BERTHELOT (extraction par la glycérine ou l’eau et précipitation par l’alcool).

Nous avons employé la méthode de HOLDERER mentionnée plus haut : les mycelium des cultures dont les milieux avaient servi pour les mesures des exodiastases sont aseptiquement lavés à plusieurs reprises avec de l’eau distillée stérilisée, puis ils sont mis

éjuoh avance! LLLPP PC TE pp coag. ave le dy. To

coa frés ferme :

coag, ferme :

commen. CIC)

codg. néant : = pré: M EE A UE 48 Pa Aim’ Fa. Mu: Présure Knda drastase:

Courbes indiquant l'action de 1cm) et de Semi de L'gurde d'iasiss rque sur em ge ut ecreme sËëeri lise. :

en macération pendant 12 heures à une température de 37° dans : 140 cc. d’eau distillée stérilisée + 10 cc. de solution de phosphate

trisodique à 10%; les récipients sont agités à diverses reprises;

après ce temps le mélange est neutralisé avec une solution N/10

d’acide chlorhydrique; après mélange on laisse en contact pendant

deux heures et on filtre à travers un filtre fin (pour opérer dans des

conditions de stérilité rigoureuse, nous avons fait usage de boîtes

de pansements stérilisés). En alcalinisant l’eau de macération

nous obtenons une solution diastasique aseptique préparée par

plasmolyse du mycelium frais.

Présure. — Pour mesurer le pouvoir diastasique de la présure, nous avons procédé de la même façon que dans le cas des exodiastases ; nous avons encore employé 1, 2, 5 cc. de liquide diastasique pour 3 cc. de lait écrémé mécaniquement et stérilisé. Nous donnons ci-dessus les courbes correspondant à r cc. et à 5 ce. de liquide diastasique pour 5 cc. de lait écrémé et stérilisé. (Fig. 25.)

Caséase. — Nous employons de nouveau le mycelium ayant servi pour l'isolement des exodiastases et la préparation du liquide diastasique intracellulaire correspond à la technique citée plus haut; le dosage est effectué par pesées (voir exodiastases). Vu la vitesse de digestion il est pratiqué après 4 heures, 8 heures, 12 heures, 24 heures. Ci-dessous un tableau exprimant nos résultats :

Après 4 heures Après 8 heures 170 = 1 gr. — 0,936 — 0,064 I gr. — 0,925 = 0,075 R O — Igt. — 0,977 — 0,023 I gr. — 0,936 — 0,064 TNaCl = 1gr. — 0,929 — 0,071 I gr. — 0,902 = 0,098 R NaCIl = 1gr.— 0,704 = 0,236 I gr. —0,528 — 0,472

Après 12 heures Après 24 heures Et © = Igr. — 0,714 = 0,286 I gr. — 0,581 — 0,419 R O — 1 gr. — 0,806 — 0,194 I gr. — 0,707 — 0,223 T'NaCl = 1gr. — 0,575 — 0,425 I gr. — 0,429 — 0,571 R NaCl = 1gr. — 0,189 — 0,811 I gr. — 0,037 — 0,963

Les courbes suivantes illustrent ces tableaux : (Fig. 26).

nm: caserne digéree parlant de1gr de casérne pire pèr Écmi de drguree diaslasrque:

Âl

(Os

apres: 08 EZ 84 128 2h faction : Casease ; Endo disstase:

Sucrase. — Le mycelium ayant servi pour la préparation des exodiastases a ici été employé aussi pour la préparation des endodiastases par macération; les dosages ont été effectués suivant le mode opératoire adopté pour les exodiastases. Le tableau suivant donne les résultats : |

I Il T O Fr 1"0,073 0,0591 R O — 0,008 0,0178 TNaCl — o,0812 0,062 R'NACI SET O0 0,0842

Trypsine. — Le mycelium ayant servi pour l’obtention des exodiastases est mis en macération après lavage; ensuite il est filtré et amené à un pH = 8,5 nécessaire pour l’action de la trypsine. Le dosage des acides aminés est alors effectué comme pour les autres diastases.

Tableau donnant Îles résultats :

cm’ de Na OH N/10 nécessaires pour neutraliser :

Aoides | Acides totaux Acides totaux après Acides aminés dus à libres avant l’action diastasique de : l’action diastasique de : l’action

diastasique athh 16 En tothn tr hs tnt | 6 hot het sth

TO 6,8 7,9 8,6 10,1 |9,4 | 9,7 |0,7 | 1,2 | 1,5 | 1,8 R O 6,9 8,3 8,8 | 8,82] 8,83|8,8310,5 | 0,52] 0,53 0,53 T NaCl | 6,9 7,8 8,6 |9,2 | 0,6 |9,7 [0,8 | 1,4 | 1,8 | 1,9. R NaC1!6,8 8,5 0,9 | 10,4! 10,0] I1,111,2 | 1,0 | 2,420

em> de 404 Vo employes pour satyrer les dcides aminés profinf du deoublèmenf de Lgr. d'Ovalbimine par LOem3 de lrqurde d'rastas rguei

après: O4 3h 64 gs 1.42% AA : Trypsrre à £ndo dies la se :

Ces résultats sont synthétisés par les courbes ci-dessus :

(Fig. 27).

Nous insistons sur l’importance des moments où les dosages ont été opérés, car après quelques jours, nous avons constaté des changements de réaction. -..- LOTO MOS SIT EMPEUL JIM

EN de

Comme on a pu le constater plus haut, nous avons tenu à examiner les modifications apportées par l’irradiation dans la concentration en ions H des milieux après 15 jours, 4 semaines et 6 semaïines et nous avons aussi jugé nécessaire de contrôler les variations se produisant dans la secrétion des diastases (intra et extracellulaires). A des époques déterminées des dosages ont été effectués par nous, ceux-ci nous ont permis de constater que, comme pour les pH, les variations les plus étendues se produisaient après 10 à 15 jours, postérieurement à l’irradiation. Après 4 semaines on peut constater une tendance à une notable diminution des écarts, tendance que nous avions déjà mise en évidence à propos de la concentration des milieux en ions H. I ne nous semble pas nécessaire de donner ici les Tableaux réunissant tous nos résultats numériques ; à titre d'exemple, toutefois, nous donnons ici un petit tableau résumant les résultats obtenus en ce qui concerne la sucrase dosée après 6 semaines (période postérieure à l’irradiation). Nous voyons qu'après 6 semaines, l’équilibre normal est rétabli, l’action du radium ou des rayons X ne se manifeste plus sensiblement:

Sucrase après 6, semaines :

Exodiastases Endodiastases ROUX Pipe 32,5 mgr.

RO ol et 21,2 imgr.

TNaCIl: 10 mgr. 31,5 mgf.

R NaCl: 10,5 mgr. 21,4 mgf.

En ce qui concerne le choix fait par nous à propos de la recherche et du dosage de l’activité diastasique, nous avons fait appel à des diastases facilement décelables; de plus celles-ci nous ont permis d'employer des méthodes quantitatives variées : pour la caséase dosage par pesée, pour la sucrase, méthode volumétrique de BERTRAND ; pouf la trypsine, la méthode de formoiltitration de SôRENSEN. Si malgré ces différents procédés employés les résultats obtenus offrent une analogie aussi frappante, cela prouve l’exactitude de nos raisonnements.

Considérons maintenant d’abord les exodiastases qui nous donnent des résultats similaires à ceux obtenus par SCHNEIDER dans ses recherches sur les levures c’est-à-dire :

I. Sans irradiation l'introduction d’un électrolyte comme le Chlorure de Sodium dans le milieu de culture fait diminuer l’activité diastasique extracellulaire,

II. En milieu non dissocié le radium fait décroître A diastasique extracellulaire, mais l’écart est très peu sensible. |

III. En milieu dissocié, l’activité diastasique extracellulaire est fortement diminuée pat le radium.

Rappellons ici les conclusions posées par SCHNEIDER dans son mémoire : L'action des rayons X (ou du radium) directement effectuée sur des êtres unicellulaires est pratiquement incommensurable et très difficilement constatable, en d’autres termes ces êtres directement irradiés ne sont guère radiosensibles.

Cependant si l’action des rayons X (ou du radium) se manifeste indirectement sur ces êtres à travers un milieu renfermant un électrolyte comme le chlorure de sodium ou en général un milieu sensibilisé par certaines substances dites photodynamiques, elle se prononce nettement et dans les phénomènes biologiques qui se produisent l’electrolyte joue le rôle de catalyseur.

Peut-être cette action renforcée est-elle en relation avec l’ionisation produite dans le milieu par l'introduction d’un électrolyte ; en effet nous le savons, dans les solutions fortement ionisées, les réactions se produisent presque instantanément suivant les lois physiques. Les corps se trouvent attaqués à l’état d’atomes ou de partie d’atomes; de cette façon les rayons n’ont pas besoin de décomposer antérieurement les molécules de grande complexité, s’il s’agit de tissus cellulaires. Quoi qu’il en soit l’action primaire des rayons paraît s'exercer par le milieu et à travers celui-ci, car la seconde partie de notre travail démontre que la cellule en elle-même n’est en premier lieu pas sensiblement lésée puisqu'elle continue à fabriquer des diastases comme auparavant, alors qu’elle n’était pas encore influencée par le radium. Par contre les résultats découlant de cette partie de nos recherches nous permettent de constater que l’irradiation agissant à travers le milieu amène un changement de perméabilité de la membrane cellulaire, car les courbes précédentes indiquant les variations de l’activité diastasique intracellulaire (endodiastases) déterminent les conclusions suivantes :

I. Sans irradiation, l'introduction d’un électrolyte, comme le Chlorure de sodium, dans le milieu de culture, augmente légèrement Pactivité diastasique intracellulaire.

H. En milieu non dissocié le radium fait décroître l’activité diastasique intracellulaire maïs, ici encore l’écart est très peu sensible.

III. En milieu dissocié l’activité diastasique intracellulaire est augmentée très sensiblement par le radium.

Il nous a paru intéressant de comparer l’activité diastasique intracellulaire et extracellulaire. Nous voyons ici qu’un écart relativement considérable se produit seulement dans le milieu dissocié et cet écart se manifeste chez les deux sortes de diastases (endo et exo) dans deux sens exactement opposés.

La somme endodiastases L exodiastases reste sensiblement constante, mais l’activité des exodiastases diminue jusqu’à tendre vers O, l’activité des endodiastases augmente jusqu’à limite du possible.

On voit donc que la cellule continue à secréter et à élaborer ses ferments, mais en présence de l’électrolyte, le radium produit une inhibition de l’activité des exodiastases occasionnée par la diminution de perméabilité de la membrane cellulaire, très probablement. Là encore nous sommes en parfait accord avec LIEBER, GRŒDEL et SCHNEIDER qui disent : «Si l’on admet une action primaire des rayons X (ou du Radium) sur les ions, on peut sans aller plus loin déduire des phénomènes troublant l'équilibre de DONNAN.

Le 90 =

Supposons que nous ayons à faire à une membrane totalement ou partiellement perméable; de chaque côté de celle-ci se trouvent des solutions renfermant des colloïdes et dans un cas des électrolytes, dans l’autre pas, qui passent ou non. Il se produit donc à travers la membrane des rapports d'équilibre obéissant au principe de DONNAN (1); il y aura donc production de phénomènes agissant sur la pression osmotique, la viscosité des solutions de protéines et sur les différences de potentiel à travers la membrane. D'autre part d’après les travaux de J. LB (2) il existe une intime relation entre les différences de potentiel de membrane et les différences de potentiel entre les électrodes à hydrogène, c’est-à-dire l'influence exercée par le pH sur ces différences de potentiel.

Dans les cas que nous envisageons, nous avons vu dans le milieu non dissocié une augmentation du pH par l’irradiation, c’està-dire une marche vers l’alcalinité. Suivant la première règle énoncée par LŒB, l’addition d’un peu d’acide ou d’alcali à une protéine isoélectrique accroît la pression osmotique et les autres propriétés fondamentales dépendant de celle-ci.

Mais comme il ressort des mesures de pH prises par nous et réunies dans le Tableau plus haut, on se rend compte que dans ce milieu (non dissocié) la modification du pH est très peu sensible, par conséquent la pression osmotique et la différence de potentiel à travers la membrane n’est guère modifiée ici; même si nous avions enregistré une légére alcalinité, l’augmentation de la pression osmotique.et des autres propriétés fondamentales en résultant, occasionne une perméabilité plus accentuée et provoque la diffusion du contenu cellulaire dans le liquide ambiant; c’est ce que vérifient nos recherches.

Dans le second cas où nous avons à faire avec un milieu dissocié nous avons vu une diminution accentuée du pH, c’est-à-dire une marche vers l’acidité; il aurait dû donc se produire le même phénomène que plus haut, mais ici intervient l’action antagoniste du chlorure de sodium. En effet suivant la quatrième règle de J. LŒB, l’addition d’un sel neutre à une solution de protéine qui ne se trouve pas à son point isoélectrique abaisse la pression osmotique, la viscosité de cette solution et les deux différences de potentiel de la membrane et du pH; c’est ce qui arrive réellement; par la modification de ces propriétés, la perméabilité de la membrane est diminuée et la diffusion à l’extérieur ne se produit plus en ce qui concerne les colloïdes. sé L

Aïnsi donc la loi des équilibres de DONNAN s’applique à ce phénomène et permet la conclusion suivante : l’action du radium s'exerce tout d’abord par le milieu ionisé sur les membranes cellulaires en modifiant les propriétés fondamentales exprimées dans les lois de J. LæB. ItR

En appliquant ces résultats au but direct que nous nous sommes proposés d’atteindre au début de ce travail, nous voyons que dans

(1) Donnan. Z. Elektrochem. T. XVII p. 572 (1911). (2) J. LæB. 19 Ies protéines (1924); 20 La théorie des phénomènes colloïdaux (1925) Ed. Alcan. 2.0 :