MILIEU DE CULTURE
Nous avons utilisé un milieu constitué par :
SOUS STADE A NE RE 200 cent. eubes.
Extrait de globules rouges de cheval . . . . . 50 cent. cubes. Eau physiologique à 8 p. 1000. 150 cent. cubes.
Chacun des éléments qui entrent dans la composition du milieu doit être l’objet de soins particuliers, tous indispensables à la bonne réussite de la culture.
SÉRUM DE LAPIN : Nous saignons habituellement les lapins à la carotide au moyen de tubes à saignée. Une fois le caillot rétracté, on sépare le sérum et on le laisse une huitaine de jours à la glacière.
SÉRUM PHYSIOLOGIQUE : Le sérum physiologique, préparé avec de l’eau redistillée et du chlorure de sodium chimiquement pur, est stérilisé à l’autoclave, vingt minutes à 120°.
L’extrait de globules rouges de cheval (1) est ajouté avant la filtration.
On fait tiédir ce milieu pour le faire passer plus aisément à travers un filtre Chamberland F.
(1) L'extrait globulare de globules rouges de cheval se prépare suivant la technique indiquée par MM. Aghulon et Legroux pour la préparation du milieu préconisé par ces auteurs pour la culture du B. de Pfeiffer.
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Le liquide est recueilli purement, après filtration, et réparti en ballons que l'on ferme à la lampe. On laisse « vieillir » le sérum au moins un mois à l'étuve à + 36° et au moment de l'utilisation, on le répartit purement dans des tubes à essais.
Il ne faut employer que des tubes en verre neutre neufs: condition strictement indispensable au succès des cultures. Le lavage de ces tubes ne peut être fait qu'avec de l'eau distillée en proscrivant tout nettoyage à l'acide.
Les tubes lavés et séchés sont additionnés de quelques centimètres cubes d'huile de vaseline. Les tubes sont bouchés au coton cardé et stérilisés à l’autoclave à 120°, une demi-heure. Il arrive souvent qu'après celte opération, l'huile de vaseline est trouble, mais elle reprend peu à peu son aspect normal; il s’agit d’un trouble par hydratation passagère.
Après contrôle, par séjour à l’étuve à + 37, les tubes peuvent ètre employés.
Nous avons déterminé, grâce à l’amabilité de M. Schoen, le pH de ce milieu de cullure : on peut utiliser celui-ci lorsque son pH est de 6,7. Le vieillissement à l’étuve a pour effet de faciliter l’acidification du milieu. En effet, tandis que, lors de sa récolte, le pH du sérum est voisin de 7,3-7,4, un mois après, le milieu s’acidifie pour atteindre un pH de 6,6-6,7. Ces milieux légèrement acides conviennent à la culture de cet organisme.
Tel est, déterminé d’une façon précise, le milieu de culture de ce spirochète: c’est donc un milieu anaérobie, légèrement acide, à base de sérum de lapin non chauffé.
Le milieu sérum de lapin constitue le milieu d'entretien par excellence de ce spirochète, et les bactéries ordinaires ne peuvent s'y développer qu'avec peine. Mais il est un autre sérum d'un emploi indispensable à notre avis : le milieu au sérum de cheval.
MILIEU A BASE DE SÉRUN DE CHEVAL. — Sa préparation est identique à celui du sérum de lapin, seule la proportion de sérum change. Un sérum de cheval ‘ vieux ” peut être employé au 1,5°; mais un sérum d'un mois doit ètreemployé à une dilution plus faible ; au 1/7° ou même au 1/10e.
La présence, dans le sérum de cheval, d'une quantité abondante de pigments biliaires, empêche la culture des spirochètes
et on ne peut utiliser un sérum riche en pigments biliaires même après vieillissement.
La plupart des bactéries, hôtes habituels de la bouche, périssent rapidement dans ce milieu qui ne renferme plus, au bout de quelques passages, qu’une bactérie mobile et des spirochètes de plus en plus nombreux.
Il était nalurel d'essayer la culture en sérum humain : nous n'avons pu obtenir sur ce milieu une culture de spirochètes même en ensemençant du matériel humain, donnant de riches cultures en sérum de lapin ou de cheval.
La température oplima pour son développement est de 29°. On peut cependant le conserver à 4+35°, mais il s’altère plus vite à cetle température.
La conservation des spirochètes dans les milieux de culture est toujours difficile et, quelles que soient les précautions prises au moment du repiquage, on risque toujours d'échouer et de perdre la culture.
Le spirochète présente un véritable cycle dont il importe de bien connaitre les différents stades pour juger de l'époque la plus favorable au réensemencement. C’est en général entre le vingt-cinquième et letrentième jour, au moment de la première division spirochétienne.1lfautensemencer abondamment : environ À cent. cube de culture pour 10 cent. cubes de milieu neuf, en ayant soin de déposer le liquide d’ensemencement dans le fond du tube.
Il est utile, à titre de précaution, de laisser dans le tube dont on s’est servi pour faire un ensemencement 2 à 3 cent. cubes de la culture-mère à laquelle on ajoute 10 cent. cubes de milieu neuf. On peut également augmenter la richesse d'une culture, en séparant, par centrifugalion, les spirochètes, du milieu dans lequel ils ont cultivé depuis un mois et en le remplaçant par du milieu neuf: il semble que le milieu de culture contienne au bout d’un certain temps des substances empêchant le développement des organismes.
Enfin, nous conservons toujours nos vieilles cultures de façon à pouvoir, en cas d'échec au cours d’un ensemencement, utiliser une de ces cultures ainsi mises en réserve. On peut alors avec plus ou moins de succès essayer de réensemencer une culture de quarante-cinq ou soixante-dix Jours, mais les cultures
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filles sont, dans ce cas, plus lentes à se développer. Le spirochète vit facilement plusieurs mois. La « durée utilisable » d’une culture est fonction, d’une part du cycle évolutif du spirochète, d'autre part des transformations que font subir ax milieu le spirochète ainsi que la bactérie avec laquelle il vit en symbiose, modifications qui rendent le milieu inapte à la multiplication du micro-organisme.
La virulence des spirochètes est fonction de l’âge de la culture, elle atteint son maximum entre la troisième et la quatrième semaine; après un mois la virulence des organismes s’alténue rapidement, elle est nulle après un séjour de deux mois dans un même milieu et semble une propriété des cultures contenant des formes jeunes.
