OBJET DU TRAVAIL ET TECHNIQUE

$ 1°’ OBJET DU TRAVAIL. Dans la partie précédente, les faits suivants ont été établis :

1°) Chez la Grenouille rousse, l’hibernation et la maturation des réserves étroitement liées ne peuvent s’effectuer que dans des limites de température relativement étroites : de 0° à + 10° environ.

2°) Normalement dans l’eau, pendant la période hibernale et la reproduction qui lui fait suite, l’animal varie peu de poids; il a plutôt

.tendance à augmentation.

3°) Si, expérimentalement, l’hibernation et une grande partie de la maturation des réserves peuvent se faire «à sec» ou dans l'air humide avec une perte de poids relativement élevée, la reproduction sexuelle et la ponte, termes ultimes de l’ovogénèse exigent une hydratation de l’animal. L’eau masque ainsi le métabolisme normal pendant l'hiver.

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4°) L'hibernation ne peut être prolongée indéfiniment, la maturité sexuelle qui fatalement lui fait suite conduit à la surmaturation, période d’inanition spéciale et de perte de poids continue.

Cet ensemble de résultats nous laisse supposer qu’il doit exister d’une part, des relations très étroites entre l’ovogénèse, la composition des œufs et celle de l'organisme total surtout au moment de la reproduction; d’autre part que, malgré la température et les facteurs externes adéquats, l’hibernation ne pouvant être prolongée indéfiniment exige pour se réaliser un état physiologique spécial de l’individu et qu’elle cesse dès que ces conditions internes ou externes ne sont plus remplies. De plus, chacun sait par l’observation courante que chez la Grenouille rousse, la formation de l’œuf mûr bourré de réserves se fait lentement. À première vue, en Octobre, au début de l’hibernation, les organes génitaux femelles (ovaires et oviductes) semblent avoir acquis leur taille définitive; et pourtant, la déhiscence avec ses modifications cytoplasmiques et nucléaires aboutissant à l’œuf mûr et à la ponte n'ont lieu qu’au Printemps. C’est l’opinion de NUSSBAUM qui prétend qu’en Octobre, chez Rana fusca, la formation de l’œuf est terminée pour la prochaine ponte.

Dans des études antérieures, j’ai montré (H. BARTHELEMY 20—21) que des œufs utérins immatures, ou de la cavité générale ou même des ovaires peuvent achever de maturer en dehors de l’organisme dans certaines conditions bien définies. Mais cette maturation in vitro n’est possible, tout au moins dans l’état actuel des recherches que pour des œufs ovariens prélevés pendant la période posthibernale. Jusqu'’alors, les tentatives faites sur des œufs prélevés dans le courant de l’hibernation ont échoué. Par suite, on peut logiquement supposer que l’accumulation des matériaux de l’œuf, la «maturation des réserves» se continue aussi pendant l’hibernation, et que la déhiscence et la maturation posthibernale in vivo comme in vitro aboutissant à la maturité ne sont réalisables que pour une composition chimique déterminée de l’œuf. Comment se fait cette maturation des réserves et en particulier pendant l’hiver? Pendant cette période, y a-t-il seulement des modifications qualitatives des constituants chimiques et en outre des variations quantitatives progressives jusqu’à la déhiscence ?

Il est donc nécessaire de rechercher et de suivre la composition qualitative et quantitative de l’oogonie pendant tout le cours de l'ovogénèse pour aboutir au moment de la ponte à la constitution caractéristique de l’œuf mûr. Et dans une même espèce, tous les œufs mûrs ontils même composition ? On peut fort bien imaginer que des œufs conte-

CRISE EE RERERS

nant une masse considérable de réserves, substances ne faisant pas partie intégrante du protoplasme en renferment des quantités variables suivant l’état général de nutrition de la‘femelle productrice. Avant tout, par des analyses nombreuses il est donc indispensable de déterminer si la composition des ovules mûrs varie avec les individus producteurs, ou si au contraire elle présente une certaine fixité.

Or, pendant toute l’hibernation, la Grenouille rousse n’ingère pas de nourriture, pondéralement elle varie peu, l’eau masquant le métabolisme. Si, pendant cette partie de l’année, les œufs augmentent de poids, ce ne peut être qu'aux dépens de l’animal total, se comportant ainsi comme des «parasites du corps» (LEBRUN 173). Mais ce passage des substances de l’organisme aux oocytes comment peut-on l’envisager ? Ou bien, au cours de la période estivale, l’animal emmagasine dans ses lieux de réserves (qui seront à préciser) les matières qu’il dirige vers les ovaires pendant l’hiver, ou bien par transformation de ses tissus, il tire les substances fournies aux œufs. Dans le premier cas, simple transport; dans le second, néoformation, et il s’agira de fixer les organes essentiels et leur rôle dans ces transformations. Il y aura donc lieu de faire l’étude comparée des variations chimiques de l’organisme total, des œufs, du foie, des corps jaunes, du muscle et de l’organisme débarrassé de ses ovaires.

Jusqu'’alors il a été impossible de préciser le déterminisme de la ponte. Sans vouloir résoudre le problème, on peut néanmoins apporter quelques indications utiles et rechercher si cette époque ne peut être définie biométriquement et biochimiquement. D'autre part, même à basse température, l’hibernation ne pouvant être prolongée indéfiniment, y a-t-il aussi des caractéristiques dans la composition de l’organisme à la fin de l’engourdissement hibernal? Enfin à l’inanition, en l’absence d’hibernation, la ponte n'ayant pas lieu, quels sont les rapports de l'œuf et de l’organisme et comment se manifeste la solidarité du tout et de sa partie ?

Au total, nous aurons donc à étudier les points suivants: 1°) Rechercher au moment de la maturation la composition de l'œuf de

Grenouille et voir si elle est fixe ou variable suivant les sujets

examinés. À la même époque examiner quelles sont les quantités

de substances accumulées dans l’animal total et dans l’ensemble des œufs. Y a-t-il un rapport constant à la fois entre ces deux catégories de valeurs et entre les poids respectifs des ovaires et du corps ? 2°) Déterminer les variations de la composition globale des œufs pendant l’ovogénèse, afin de voir si l’on peut caractériser chimique-

et ME tue

ment l'époque précédant immédiatement la maturité. Par comparaison, nous aurons à suivre les transformations chimiques des principaux constituants de l'animal et de ses organes de façon à nous rendre compte si les éléments constitutifs de l'œuf et en particulier les graisses sont accumulées par suite d’un simple déplacement des réserves de l’organisme ou si au contraire il y a néoformation aux dépens des tissus et quels sont les organes qui peuvent jouer un rôle dans ces modifications.

3°) Fixer le pourcentage des constituants et en particulier de l’eau et des graisses de l’organisme à la fin de l’hibernation, afin de rechercher si ces valeurs représentent une caractéristique biochimique à cette époque et si l’on peut leur attribuer un rôle dans la cessation de la vie de torpeur puis dans la déhiscence et les phénomènes de reproduction.

4°) En l'absence d’hibernation, voir les rapports de l’œuf et de l’ani-

. mal total et saisir si possible les causes pour lesquelles la maturation

n'a pas lieu.

Sur ces études, différents problèmes secondaires viendront se gref-

fer ; nous les examinerons au passage.

$ 2. TECHNIQUE. Récolte et prélèvements des animaux. Les Grenouilles utilisées ont toujours été recueillies aux différentes époques de l’année dans la même région aux environs de Strasbourg. Après 2 ou 3 jours de séjour dans l’eau à 8° ou 10° pour les réhydrater, les animaux de tailles et de poids variables sont sacrifiés. Très rapidement, on pèse d’abord l’animal total; puis les différents organes: ovaires, foie, corps adipolymphoïdes, muscles, etc. . . . sont prélevés et pesés à leur tour. Chaque partie subit de suite le traitement approprié.

Quelques analyses ont été effectuées sur des œufs utérins ou pondus préalablement débarrassés de leur gangue de mucine par le procédé de BATAILLON (38—39) au cyanure de potassium en solution dans l’eau à 8 pour mille. |

Recherches chimiques. Elles ont porté sur la teneur en eau, azote, acide gras totaux, insaponifiable total, cholestérine et indices d’iode.

Ainsi que TAMURA l’a montré, la dessiccation indispensable pour la détermination de l’eau rendant impossible un dosage exact des matières grasses, on a dû parfois dans les différentes périodes prélever un lot de sujets pour l’analyse des substances grasses et lipoïdiques et l’étude des indices d’iode et un autre lot pour la recherche de l’eau et de l'azote total.

Teneur en eau. Pour le dosage des substances sèches, les matériaux pesés aussitôt après la mort de l’animal sont placés à l’étuve à 100° jusqu’à poids constant. L’eau s’obtient par différence. Détermination de l'azote total. L’azote total est dosé par la méthode de KJEHLDAHL (combustion par l’acide sulfurique en présence d’un cristal de sulfate de cuivre, dosage titrimétrique de l’ammoniaque distillé à l’aide de l’appareil de SCHLESING-AUBAIN), sur la matière desséchée précédemment.

Dosage des matières grasses. Une partie des dosages des substances grasses et lipoidiques a été effectuée par la méthode de KUMAGAWA- SUTO (168) donnant l’ensemble des acides gras et de la chlolestérine, associée à la méthode de WINDAUS (319) qui fournit la totalité de la cholestérine. Les acides gras sont obtenus par différence.

Les plus nombreux dosages ont été faits par la méthode de LEME- LAND, (177—178) très légèrement modifiée.

A) MÉTHODE DE KUMAGAWA-SUTO et de WINDAUS: Une première série d'opérations (saponification par la lessive de soude à 25 pour cent, régénération des acides gras par HCI, extraction par l’éther sulfurique et l’éther de pétrole et évaporation jusqu’à poids

constant) fournit l’extrait lipoïdique total; c’est-à-dire la somme des acides gras totaux sans égard à la nature des combinaisons diverses dans lesquelles ils étaient engagés et du total des substances insaponifiables sans considération de leur diversité possible de constitution.

Dans un second temps, de l’extrait total précédent dont les acides gras ont été préalablement saponifiés par la potasse et la soude alcooliques, on extrait par l’éther de pétrole l’ensemble des substances insaponifiables obtenues finalement après évaporation et dessiccation à poids constant.

Enfin dans un troisième temps, par la méthode de WINDAUS, l’insaponifiable dissous à chaud dans l’alcoo! absolu donne par addition d’une solution alcoolique de digitonine puis d’eau, un précipité qui, recueilli sur filtre taré et après dessiccation représente le composé digitonine-cholestérine. Le poids de ce complexe multiplié par 0,2431 donne la valeur de la cholestérine.

Le calcul permet d’obtenir facilement: les acides gras par différence entre l’extrait lipoïdique total et l’insaponifiable total; et l’insaponifiable X (substances indéterminées autres que la cholestérine) par différence entre l’insaponifiable et la cholestérine.

SVT UE

B) LA MÉTHODE DE LEMELAND, donnée comme une simplification et un perfectionnement de ceile de KUMAGAWA-SUTO comprend les temps suivants:

a) Extraction. Les tissus prélevés et hâchés immédiatement après la mort sont conservés dans l’alcool à 95°, puis placés dans la cartouche d’un appareil de KUMAGAVWA et épuisés à chaud pendant 8 heures par l’alcoo! à 95°. L’extrait alcoolique contenant la totalité des lipoïdes est desséché en s’aidant du vide. b) Saponification. Le résidu précédent est saponifié à reflux pendant deux heures avec 25cc de potasse alcoolique binormale. Puis l’addition de 28cc d’eau distillée, 28cc d’alcool à 95°, 44cc d’acide chlorhydrique normal et le chauffage un quart d’heure à reflux assure la salification des acides gras que l’acide chlorhydrique aurait pu libérer.

c) Séparation et dosage de l’insaponifiable total. — De la solution hydroalcoolique de savons, ainsi que du rinçage du ballon avec de la potasse décinormale dans l’alcool à 50°, le tout passé dans une ampoule à décanter, on épuise à trois reprises par de l’éther de pétrole (P. E. — 50° à 60°) la totalité des substances insaponifiables. Les savons restent dans la phase hydroalcoolique. Après deux lavages avec 50cc et 30cc d’eau distillée réunis à la phase hydroalcoolique pour éviter toute perte d’acides gras, l’éther de pétrole évaporé, puis séché à l’aide du vide est redissous dans 10 cc. d’alcool absolu, additionnés de 1 cc. de soude alcoolique décinormale. Une nouvelle déssication dans le vide; l’addition de quelques centimètres cubes d’éther de pétrole anhydre, un repos de 12 heures permettant à la partie non-soluble d’adhérer aux parois du verre, la filtration sur amiante et sable dans un petit ballon taré, puis l’évaporation et le séchage à 65° pendant 3 heures fournissent un résidu, qui pesé est l’insaponifiable total.

d) Régénération et dosage des acides gras. — La solution hydroalcoolique de savons, additionnée de 20cc de HCI pur concentré est épuisée dans une ampoule à décantation par l’éther de pétrole (P. E. — 30° à 50°, 100cc, — 50cc, — 40cc, — 40cc, — 40cc,). Après lavage avec 100cc d’eau distillée pour éliminer toute trace d’acide chlorhydrique et distillation de l’éther de pétrole, le résidu desséché à chaud et dans le vide est repris par quelques centimètres cubes d’éther de pétrole sec (P. E. — 30° à 50°). 12 heures de repos pour permettre la précipitation des parties non-solubles, puis la solution d’acides gras filtrée sur amiante et sable dans un petit ballon