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parois cellulairés, des grains d’aleurone et une certaine quantité de cytoplasme avec les noyaux.

« L'huile filtrée qui s'écoule est trouble, elle contient en suspension un mélange de grains d’aleurone et de cytoplasme avec quelques fins débris de membranes cellulaires.

« Reste à séparer ces composants de la cellule. Voici une méthode qui permet d'atteindre ce but :

« On centrifuge l'huile additionnée ou non d’un dissolvant dans un appareil à grande puissance, et l’on obtient dans le tube du centrifugeur, après un certain temps variable avec la fluidité du mélange et la vitesse de l'appareil, deux couches bien distinctes. L'examen microscopique de celles-ci permet de faire la constatation suivante : la couche inférieure blanchâtre est constituée par les grains

d’aleurone accompagnés par quelques débris de

membranes cellulaires ; la couche supérieure grisâtre n’en renferme plus ou à peu près, la vitesse de l’appareiïl ayant eu pour effet de réunir au fond du tube les grains d’aleurone petits et gros. Cette couche supérieure est alors presque uniquement constituée par le cytoplasme, un certain nombre de noyaux fort petits dans le cas actuel et quelquesuns des grains d’aleurone ayant pu échapper à la filtration et à la centrifugation.

« On peut débarrasser le cytoplasme ainsi préparé

‘de l'huile qu'il contient encore en forte proportion,

en ayant recours à un solvant ; en centrifugeant à nouveau on l’obtient à l’état sec. »

M. Nrczoux signale que « ...cette souche supérieure

«est alors presque uniquement constituée par le cyto- « plasme, un certain nombre de noyaux fort petits « dans le cas actuel et quelques-uns des grains d’aleu- « rone ayant pu échapper à la filtration et à la cen- « trifugation. »

Nous avons nous-même constaté qu’en suivant très exactement la technique citée, on obtient un produit encore souillé par les grains d’aleurone dont il faut se débarrasser avant d'entreprendre une étude chimique du cytoplasme.

Les auteurs allemands, s'inspirant des travaux de M. Niccoux, ont également isolé le cytoplasme en suivant une technique analogue.

Les semences décortiquées sont dégraissées soit par expression à froid, soit par un solvant, chloroforme ou tétrachlorure de carbone (FALx et Nezsow). HALEY et Lymanx (21) ont eu recours à l’éther de pétrole bouillant à basse température. HoyEer (24) a obtenu des préparations de concentration enzymatique élevée par emploi de solvants de densités différentes. JALAN- DER à repris les directives de M. NicLoux et obtenu un produit semblable.

En 1910, Tanaka a montré que l’on pouvait obtenir un ferment activé d'emblée en faisant digérer les graines de Ricin par une quantité convenable d'acide acétique dilué, puis en les lavant à l’eau pour entrafner les matières solubles et en séchant ensuite.

ARMSTRONG et Gosney ont légèrement modifié la technique de Tanaka. Les graines, décortiquées et broyées, sont dégraissées par deux digestions successives dans l’éther de pétrole et une dernière digestion

PP ps

dans l’éther ordinaire. Le résidu pulvérisé est mélangé au mortier avec de l'acide acétique décinormal. Après 15 minutes de contact, le liquide est filtré et le résidu lavé plusieurs fois à l’eau est desséché incomplètement dans le vide, puis pulvérisé et tamisé. Neuf parties de graines donnent ainsi une partie de ferment qui saponifie en 20 heures à 30°, 10 parties d'huile dans la proporüon de 90 p. 100, sans addition préalable d'acide, simplement en présence d’un excès d’eau. ARMSTRONG et Gosxey ont mis en évidence le pouvoir synthétisant du ferment ainsi chbtenu, en le mettant en contact avec un mélange de glycérol anhydre et d’acide gras de l'huile d'olive.

Préparation de la Lipase activée

de MM. À. Morel et L. Velluz

MM. A. More et L. VELLUz, reprenant les travaux de TANAKA, ARMSTRONG et GosnEy, ont décrit une préparation de lipase activée. Le pouvoir du produit obtenu d’après la technique de ces auteurs est remarquable à la fois par son pouvoir saponifiant élevé et son pouvoir synthétisant. Les deux phénomènes se produisent sans addition d'acide. La technique suivie est la suivante :

« Technique. — Les graines décortiquées et fine- « ment broyées, au moment même de leur emploi, « sont intimement mélangées avec de l'huile d'olive, « en-proportions déterminées On mélange 70 gr. de « graines et 200 gr. d'huile. Puis on centrifuge à une « vitesse de 3.000 tours environ-et on décante soi-

ae. Ne

gneusement la couche supérieure renfermant le cytoplasme en suspension dans l'huile. On filtre à la trompe cette fine suspension, jusqu'à ce qu on ait recueilli 160 gr. d'huile. On conserve la masse qui reste sur l’essoreuse et qui représente environ 10 gr. de cytoplasme et 20 gr. d'huile.

« Cette masse détachée est additionnée de 80 cm° d'acide acétique décinormal et on laisse en contact pendant une heure à l’étuve à 37° ou plus simplement à la température du laboratoire le mélange dont on a eu soin de réaliser l’homogénéité parfaite. « On essore complètement à l’aide d’une trompe et le résidu est traité à nouveau par 120 cm* d’eau distillée. On essore une deuxième fois à fond et très rapidement, puis la masse est dégraissée par l’éther ordinaire et centrifugée ; le résidu mis rapidement dans une cloche à vide, où l’on ne laisse plus que quelques millimètres de pression, en présence d’aci-

de sulfurique. On a soin d'éviter autant que possible

une exposition prolongée à la lumière. Le résidu sec de coloration grisâtre est finement pulvérisé au mortier d’agate et conservé dans le vide et à l'obscurité. On obtient 4 gr. 60 environ de ferment pour les 70 gr. de graines décortiquées mises en œuvre, soit 6,90 %.

« On peut modifier cette technique en isolant dès le début le cytoplasme de sa suspension huileuse de l’éther de pétrole et l’éther ordinaire et en centrifugeant, suivant la méthode d'isolement de Ni- CLOUX, puis en desséchant le produit dans le vide.

On le conserve ainsi à l’abri de l'humidité et de la

« lumière et on l’active plus tard, en mettant 10 gr. « en suspension dans 20 gr. d'huile d'olive et en « homogénéisant ce mélange avec 80 cm° d'acide « acétique décinormal, puis en terminant la prépa- « ration comme précédemment. Les résultats sont les « mêmes. » #0

L'étude comparative de ces différentes méthodes de préparation du cytoplasme nous a permis de faire les remarques suivantes :

Les techniques qui ont recours à des solvants tels que le chloroforme, le tétrachlorure de carbone, le sulfure de carbone, l’acétone, fournissent des produits peu ou pas du tout actifs. Les pertes d'activité sont de l’ordre de 50 %,, voire de 65 %,, ainsi que nous avons pu le constater.

Pour ce qui est de l’acétone nos essais sont en désaccord avec ceux de WiLLSTATTER et WALDSCHMiIDrT- Lerrz, qui écrivent dans leur mémoire paru en 1924: « ….Ces essais — dégraissage à l’acétone — nous ont montré que l’acétone n'avait pas d'action nuisible. »

Ces résultats discordants proviennent sans doute de temps de contact différents entre le dissolvant et les graines. Nous avons, en effet, constaté que le temps de contact a une importance extrême. Certaines de nos préparations ont été dépourvues de toute activité par suite d’un contact trop prolongé.

Nous avons remarqué, en accord avec les auteurs allemands, que la glycérine et le glycol diminuaient le pouvoir saponifiant de la lipase. L'alcool éthylique a une action nocive manifeste.

Deux dissolvants nous ont paru particulièrement ”

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indiqués pour le dégraissage des graines et de la lipase. Ce sont l’éther de pétrole et l'éther éthylique. On peut admettre que ces deux dissolvants possèdent une action moins brutale sur le substratum colloïdal du ferment. 11 faut toutefois remarquer que ces solvants par un contact prolongé, ont une action destructive aussi marquée que les autres.

Quant à l’action de l’eau et des réactifs aqueux sur la lipase, les conclusions des auteurs sont contradictoires. Pour M. NicLoux, en accord avec Hoyer, l’eau détruit ou affaiblit dans de notables proportions l’action hydrolysante du ferment. HaLey et LYMan ont fait la même observation. TANAKA, ARMSTRONG et Gos- NEY, MM. A. More et L. VezLuz obtiennent un produit actif en traitant le ferment par l’eau acidulée par l'acide acétique.

Ces contradictions s'expliquent à notre avis par le fait que l’on compare des produits très différents. D'autre part, les détails les plus minimes d’une technique ont une importance capitale : temps de contact entre les graines et un dissolvant ou un réactif aqueux, degré de dessiccation, etc...

D'après les nombreuses préparations et observations que nous avons pu faire, on peut dire que le ferment rigoureusement privé de tout corps gras est extrêmement sensible aux réactifs aqueux, à l’humidité atmosphérique, à la lumière. Sous cet état physique, il supporte sans perte d'activité l’action de l’éther de pétrole et de l’éther éthylique, à condition que le temps de contact soit extrêmement court.

Partiellement dégraissé, ou mis en suspension dans

Site l'huile, un traitement même prolongé par les réactifs aqueux est sans action sur son pouvoir hydrolysant.

On peut d’ailleurs supposer que dans le cas de l'activation par l'acide acétique le support colloïdal de l’enzyme prend une certaine charge qui lui confère une résistance vis-à-vis de l’eau.

D'après WizzsraTreRr et WazLDscaminr-Lerrz, l’état colloïdal jouerait un grand rôle dans l’activité du ferment. Constatant l'extrême influence des solvants et des réactifs aqueux sur le pouvoir saponifiant, ils se sont demandés si pendant le dégraissage ces solvants « n'’agissaient pas sur la dispersion et l’état colloïdal de son support ».

Partant de cette hypothèse discutable, ils ont songé à protéger la lipase, au cours du dégraissage, en la mélangeant au Kieselgur, employé comme agent de dilution ét non comme adsorbant.

Préparation de la Kieselgur lipase

Dans ce but ils ont donné la technique suivante :

TecaniQuEe. — « 1 kilo de graines de Ricin décortiquées sont broyées en présence de 14 kilos d’eau. L'émulsion ainsi obtenue est centrifugée à 3.000 tours. Cette crème, dont le pouvoir lipasique serait diminué par dégraissage ou dessiccation, est mélangée à 333 gr. de Terre d’Infusoires (Kieselgur). On obtient une pâte

LUN) Het

que l'on peut soit dégraisser et dessécher en une seule opération par traitement à l’acétone et à l'alcool, soit dessécher à l’étuve, puis dégraisser par un solvant neutre dans un appareil à extraction.

0 gr. 2944 de lipase adsorbée sur Kieselgur, correspondant à 1 gr. de graines de ricin décortiquées, mis en présence de 2 gr. 50 d'huile et de 2 gr. d'eau à une température de 20° et en 20 minutes saponifient 18 % d'huile. »

Cette technique ne présente qu'un intérêt très relatif. Le produit obtenu est impur, souillé de Kieselgur et faiblement actif. Nous avons fait trois préparations de « Kieselgurlipase » et nous avons constaté que l’activité était très inférieure à celle annoncée par les auteurs. Cela tient sans doute à la rédaction voiontairement obscure de la technique qui a fait l’objet d’un brevet, en vue d’applications industrielles possibles. |

Ces auteurs semblent d’ailleurs accorder leur préférence à la méthode suivante, dans laquelle on n’a pas recours au Kieselgur. Voici cette technique telle qu'elle est exposée dans Oppenheimer (Article « Lipa- sen den Samen ». Edition 1929). Il est à noter que dans tout l’article consacré à la lipase dans cet ouvrage il n’est pas question de la technique au Kieselgur. Faut-il voir là une preuve des mauvais rendements obtenus en employant la méthode préconisée dans le mémoire de WiLLSTATTER et WALDSCHMDT-

Lerrz (1924) ?

nt Préparation de la crème de ferment (Ricinuslipase)

TECHNIQUE. — « 20 grammes de graines de Ricin décortiquées renfermant 150 unités Phytolipase E. (1) sont broyées dans un mortier jusqu’à obtention d’une pâte visqueuse. Cette pâte est intimement mêlée avec 140 cm° d’eau, ajoutée par fractions de 15 cm. Le lait ainsi formé est centrifugé 15 minutes à 3.000 tours. Il se forme trois couches : une couche supérieure constituée par une crème assez épaisse, au fond du tube un dépôt solide, entre ces deux couches une solution presque claire.

Après séparation de la crème et élimination de la solution aqueuse, on reprend le culot inférieur avec environ 140 cm° d’eau que l’on mêle intimément. On centrifuge, on obtient ainsi une petite quantité de crème que l’on ajoute à celle précédemment obtenue.

La crème contient 90 % de la lipase.

Le culot contient 7 % de la lipase. »

La sensibilité extraordinaire de la lipase de Ricin

() WrcisratTrer et WazpscamptT-Lerrz donnent la définition suivante de cette unité :

« L'unité Ph. L. E. (Phytolipase einheit) est la quantité « d’enzyme, qui, dans les conditions du titrage, à 20°, pour « un Ph. de 4,7, réalisé par un tampon acétique de 2 cm3 « (1 cm3 d’acétate d’ammoniaque demi normal + [1 cm.3 « d'acide acétique deminormal), saponifie 2 gr. 50 d'huile « d'olive, d'indice de saponification 185,5 dans la propor- « tion de 7,5 ",. »

« Si la saponification dépasse 45 ‘, la méthode de mesures « est inapplicable. »

est une difficulté pour obtenir un produit sec sans nuire à son activité. Parmi les nombreux procédés essayés par WizzsTATTER et Wacpscamipr-Lerrz, celui qui semble préférable consiste à dessécher la crème à l'air jusqu’à une perte de poids de 30 %. La dessiccation à poids constant altère l’enzyme. Cette dessiccation s'opère de la façon suivante :

« La crème est étendue en couche mince et soumise à un courant d’air tiède. Même privée partiellement d’eau, l’enzyme est très sensible à l’action des solvants des graisses. Le meilleur procédé de dégraissage consiste à placer la crème sous une cloche remplie de vapeurs d’éther pendant 36 heures. C’est alors qu’on fait agir l’éther directement.

15 grammes d’une crème à teneur de 106 unités Ph.L.E. sont étendus sur une plaque de verre et séchés pendant deux heures dans un courant d'air rapide à 36°.

10 grammes de crème desséchée, placés dans une capsule, sont mis sous une cloche de verre pendant 36 heures au-dessus d’une couche d’éther. L’enzyme est ensuite délayée dans 100 cm° d’éther. On centrifuge. L’enzyme est lavée trois fois dans le tube à centrifuger avec chaque fois 30 cm° d’éther et séchée dans un dessiccateur.

L’enzyme obtenue pèse 0 gr. 60 et contient 7 unités Ph L. E., correspondant à 71 % de l’activité de la crème sèche. La concentration de la lipase est done 16 fois celle des graines décortiquées. »

Nous avons également contrôlé cette méthode qui donne de bons résultats. Mais on doit signaler que

es

si le produit obtenu est actif, il n’atteint pas le degré de pureté de la « lipaséidine » de M. Niczoux.

Afin d'obtenir un produit très pur absolument exempt de grains d’aleurone et susceptible d'être soumis à des investigations chimiques, nous avons adopté la technique suivante :

Technique | personnelle

À. — EXTRACTION DU GYTOPLASME. — 20 grammes de graines de Ricin, soigneusement décortiquées, sont broyées au mortier en consistance de pâte très fine. Cette pâte est délayée avec 80 cm° d’acétate d’éthyle (D = 0,873), ajouté par fractions de 20 cm°* On obtient une émulsion laiteuse qui est centrifugée aussitôt dans un centrifugeur tournant à 3.000 tours. Le culot de centrifugation présente deux couches distinctes : la couche inférieure est constituée par les débris de membranes cellulaires, la couche supérieure blanche par les grains d’aleurone et les noyaux des cellules.

Les liquides de centrifugation d'apparence laiteuse sont réunis dans un ballon à long col, et dont le bouchon laisse passer deux tubes d’inégale longueur. Ce ballon est retourné et au bout de quelques instants une sédimentation s'opère. Les couches inférieures contenant le cytoplasme sont réparties au moyen du petit tube dans des tubes de centrifugeur. Le grand tube permet la rentrée d'air à la partie supérieure du ballon sans qu'il y ait une agitation au sein du liquide, qui remettrait le cytoplasme en suspension. De cette façon les liquides centrifugés sont beaucoup plus ri-

Tapie

ches en cytoplasme et la centrifugation se trouve de ce fait considérablement diminuée. Détail qui a son importance, car on ne peut laisser impunément le ferment en contact prolongé avec l’éther acétique. Après centrifugation du liquide ainsi prélevé, le cytoplasme rassemblé au fond du tube est détaché et mis dans une cloche à vide au-dessus de l’acide sulfurique et à l'abri de la lumière. (L’éther acétique provenant d’une opération peut être récupéré par distillation dans le vide.)

Ce cytoplasme est absolument exempt de grains d’aleurone ainsi que nous l’ont prouvé de nombreux

examens microscopiques.

B. — Acrivarion pu cyToPLAsME. — Le cytoplasme qui à subi un traitement à l’éther acétique retient encore sur sa surface une couche de corps gras. Il faut un épuisement prolongé par l’éther de pétrole pour parvenir à éliminer les corps gras qui imprègnent le ferment.

Bien que ce ferment retienne encore une certaine quantité d'huile sur sa surface, nous lui incorporons environ 1/10° de son poids d'huile d'olive avant de l'activer. Si l’on ne pratique point ce traitement préalable, on diminue l’activité saponifiante du ferment.

Pour l'activation du ferment nous suivons, aux détails près, la technique de MM. A. Morez et L. VELLUZ. u

Après traitement par l'huile, le cytoplasme est additionné de 50 cm° d’acide acétique décinormal. On laisse en contact 20 minutes à 37°, en agitant conti-