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Aussi Aronson‘ eut-il recours au cheval dont le sérum est peu toxique pour l’homme; il est le premier qui ait préconisé cet animal pour la préparation du sérum antidiphtéritique.

Ainsi donc, des progrès considérables avaient été faits en Allemagne depuis 1890. Behring et Kitasato avaient posé le principe et, depuis lors, on s’était efforcé de trouver une méthode qui rendit plus facile la préparation du sérum; ces recherches avaient également bien abouti, puisqu’en 1894, avant la communication de Roux, il y avait en Allemagne des fabriques de sérum antidiphtéritique.

Ces faits n’étaient connus en France que de quelques initiés; peu de travaux avaient paru sur la question. En 1893 seulement, dans les Archives de médecine expérimentale et d'anatomie pathologique, Koudrevetzki donne les résultats d'expériences faites pour étudier les propriétés immunisantes du sérum du sang et des extraits des organes des chiens intoxiqués par le poison diphtéritique. Il injectait dans la veine d’un chien de fortes quantités de poison dipthéritique. Le chien était tué au bout de vingt à trente heures; son sérum et les extraits de ses organes incorporés à des cobayes, communiquaient à ces animaux une résistance manifeste contre le poison diphtéritique. Mais cette immunité s’affaiblissait avec le temps et était, du reste, d’un degré peu élevé; car ces cobayes devenaient malades et tombaient dans une cachexie progressive pour succomber enfin en quelques semaines; Koudrevetzki refit alors les mêmes expériences sur le rat, qui est connu

! Aronson, Bertin. klin. Wochenschr., 1894.

A Le De pour son immunité naturelle contre la diphtérie. Cet animal peut supporter, sans trop réagir, des doses considérables de poison diphtéritique ; mais, dans les extraits d'organes de ces rats intoxiqués, Koudrevetzki ne put découvrir d’antitoxine.

Cet auteur chercha un procédé pratique d’immunisation contrela diphtérie. ILessaya plusieurs moyens pour atténuer la virulence de la toxineinjectée aux cobayes. Mais, ni l’eau iodée, ni le liquide de Gram, ni l'ozone, ni le permanganate de potasse ne lui donnèrent derésultats satisfaisants. Il essaya alors de substituer la voie stomacale à la voie sous-cutanée ; les cobayes résistérent un peu plus, mais d’une façon encore insuffisante ; les lapins restèrent aussi sensibles ; il ne put pas non plus conférer l’immunité aux cobayes par l’injection sous-cutanée de très petites doses de cultures virulentes ou filtrées; après deux ou trois injections, les animaux tombaient dans un état d’amaigrissement progressif et succombaient dans la cachexie. Koudrevetzki conclut que les cobayes et les lapins se prêtent mal à l'étude de la question. Il essaya alors d’immuniser une chèvre, d’après la méthode de Behring. La chèvre reçut d’abord des cultures filtrées et préalablement portées à 63-70 degrés pendant une heure; puis des injections des mêmes cultures filtrées, mais traitées par le trichlorure d’iode, puis enfin des cultures filtrées n’ayant subi aucune préparation. De plus, au commencement de limmunisation, la chèvre reçut pendant plusieurs jours, avec du son qu’elle prenait, des cultures filtrées ou non, à la dose de 100 à 150 ‘centimètres cubes par repas ; un e saignée, faite quatre mois et demi après la première injection, fournit un sérum très actif; mais, son action immu-

nisante, très énergique contre les cultures filtrées, était insuffisante contre les cultures diphtéritiques vivantes. Au point de vue de la facilité d’immunisation, la chèvre de Koudrevetzki se montra assez sensible à l’action du poison diphtéritique : la réaction locale était assez intense, Du côté de l’état général, à plusieurs reprises, il y eut une forte élévation de température, l’animal avait l’air bien malade, ne mangeait rien ; il fallait bien espacer les injections.

Nous avons exposé, avecquelquesdétails, les recherches de Koudrevetzky parce qu’en somme, ce sont les seules qui aient été publiées en France avant la communication de M. Roux.

Cette communication eut un grand retentissement en France; elle contenait la technique pour arriver facilement à l’immunisation des chevaux et de plus des statistiques tout à fait favorables au nouveau traitement. MM. Roux et Martin, pour immuniser les animaux, donnèrent la préférence à la méthode des toxines iodées, déjà connue depuis lougtemps ; la toxine diphtéritique additionnée d’iode étant beaucoup moins dangereuse, MM. Roux et Martin ajoutaient à la toxine, et au moment même de l'employer, un tiers de son volume de liqueur de Gram; un lapin de taille moyenne supportait d'emblée 1/2 centimètre cube de ce liquide ; au bout de quelques jours, ils renouvelaient l'injection, puis ils continuaient ainsi pendant plusieurs semaines ; ensuite, ils augmentaient les doses de toxine iodée, ou diminuaient la proportion d’iode; plus tard, ils donnaient la toxine pure; si les animaux diminuaient de poids, ils interrompaient les injections et évitaient ainsi de les amener à un état de cachexie, qui se serait terminé par la mort. En somme, ces auteurs mettaient en pratique

Vie une méthode qui, dès 1890, avait été utilisée par Behring en Allemagne.

MM. Roux et Martin expérimentèrent sur les moutons et sur les chèvres et, ainsi que Behring l'avait précédemment établi, ils constatèrent que ces animaux étaient lres sensibles à l’action du poison diphtéritique. Les chèvres notamment tombaient quelquefois, même longtemps après le début de l’expérience, dans un état d’amaigrissement et de faiblesse extrêmes ; cependant, le sérum de ces animaux cachectiques, manifestait des propriétés préventives, quand on l’injectait aux cobayes; de plus, l’antitoxine passait dans le lait, ainsi qu'Ehrlich l’avait déjà établi.

MM. Roux et Martin, avec le concours de M. Nocard, firent alors quelques essais d’immunisation sur les vaches ; ils trouvèrent qu'une vache en lactation et bien immunisée est une source d’antitoxine ; le lait, qu’elle donne, est, sans doute, bien moins actif que son sérum sanguin ; mais, il est possible de condenser sous un petit volume l’antitoxine qu’il contient. Quelques-unes de ces expériences donnèrent de bons résultats. Nous trouvons notamment, dans une observation de M. Nocard, l’histoire d’une vache en lactation, qui, au bout de six mois, avait été immunisée ; le pouvoir préventif de son sérum était de 20000 : elle avait reçu en tout 591 centimètres cubes de toxine sous la peau et, finalement, sa santé était parfaite. Mais l’immunisation avait été longue, l’animal se montrait très sensible aux premières injections ; la température s'élevait beaucoup ; elle montait de 0,5 à 1 degré en moyenne et atteignait quelquefois 40 degrés. Les autres expériences, faites surles vaches par les mêmes auteurs,

ont montré combien elles étaient sensibles à l’action du poison diphtéritique ; une d’entre elles a succombé en cours d’immunisation, à la suite de l'injection de 5 centimètres cubes de toxine diphtéritique. Outre des lésions locales très étendues, on trouva à l’autopsie une uéphrite parenchymateuse très prononcée. $i l’on considère qu’au moment de la mise à bas, la sensibilité au poison est encore augmeutée, on voit que l’immunisation des vaches, comme celle des chèvres, exige beausoup trop de ménagements pour qu’on puisse retirer quelque avan tage partique du choix de ces animaux.

L’âne ne parut pas non plus à MM. Roux et Martin supporter suffisamment bien la toxine diphtéritique : un ânon de six mois succomba après deux injections d” 1 centimètre cube de toxine faites à huit jours d’intervalle l’une de l’autre.

C’est alors que MM. Roux et Martin immunisèrent des chevaux ; le cheval avait été déja préconisé par Aronson de Berlin ; cet auteur avait montré que cet animal réagit peu sous l'influence des injections de toxine et que néanmoins son sérum est très actif ; de plus, il est peu toxique pour l’homme, même à des doses considérables ; injecté sous la peau, il est résorbé en quelques instants sans amener de réaction locale. De plus, il est facile de retirer de la jugulaire d’un cheval, avec une pureté parfaite, de grandes quantités de sang, d’où se sépare un sérum très limpide.

Les chevaux, immunisés par MM. Roux et Martin supportèrent bien les injections de toxine ; chez plusieurs d’entre eux, 2 à 5 centimètres cubes de toxine forte, injectée d’emblée sous la peau, ne provoquèrent qu’une fièvre

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passagère et un œdème local assez promptement dissipé. Les chevaux furent assez rapidement immunisés et purent fournir de grandes quantités de sérum antidiphtéritique.

Si nous précisons par un exemple, nous voyons qu'un cheval a été immunisé par M. Roux en deux mois et vingt jours ; pendant ce temps, il a reçu 800 centimètres cubes de toxine tuant un lapin de 500 grammes en quarante huit heures, à la dose d’un dixième de centimètre cube. Comme réaction, il n’y eut qu'un œdème local passager et une élévation de température d’1 degré environ, le soir des jours où l’injection avait été copieuse. Le 87° jour, le cheval fut saigné, on introduisit dans la jugulaire 200 centimètres cubes de toxine sans qu’ilse produisit de réaction; e sérum recueilli avait un pouvoir préventif supérieur à 50000.

Dans le cours de ce travail, nous aurons plusieurs fois à revenir sur les recherches du D' Roux, pour montrer les rapports qui existent entre ses observations et celles de M. le professeur Arloing. On verra de plus en plus que si le mérite de la découverte ne revient pas au D' Roux, du moins, c’est lui qui a bien décrit la méthode à suivre et qui a ainsi largement contribué à vulgariser la sérumthérapie en France et à l’accréditer dans les milieux scientifiques et médicaux.

Préparation de la toxine diphtéritique.

D'après l’aperçu historique que nous venons de donner sur l’immunisation des animaux contre la diphtérie, on conçoit facilement quelles seront les diverses phases de la préparation du sérum antidiphtéritique ; ce sérum, étant le produit de réaction d’un animal soumis à l'action des toxines du bacille de Lüffler, il faut :

1° Préparer la toxine ;

2° Inoculer la toxine à un animal;

3° Après un temps convenable, saigner cet animal et retirer de son sang le sérum antitoxique.

Préparation de la toxine. — La première condition indispensable consiste à se procurer un bacille de Lôffler assez aclif pour que sa culture, âgée de vingt-quatre heures, tue un cobaye de 300 grammes en un jour. On ensemence ce bacille dans des vases à fond plat (flacons de Fernbach), contenant chacun 1/2 litre à 1 litre de

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bouillon alcalin peptonisé à 2 pour 100; le bacille étant essentiellement aérobie, il faut que la couche liquide ait une faible épaisseur. Les flacons et le bouillon ont été préalablement stérilisés à lautoclave; on les porte à l’'étuve à 37 degrés; mais, dans ces conditions, il faudrait laisser les cultures à l’étuve pendant des mois, pour que le poison s’accumule en quantité suffisante; aussi, pour activer la préparation, est il nécessaire de faire passer dans la culture un courant d’air humide suivant le procédé de MM. Roux et Yersin : chaque flacon est muni d’une tubulure latérale inférieure ; chacune de ces tubulures est reliée par un tube de caoutchouc à un ajutage d'ün tuyau de cuivre, qui est lui-même en relation avec une trompe à eau; des pinces à vis sont placées sur les tubes de caoutchouc et permettent de régler le courant d’air, qui pénètre dans le col de chacun des flacons, après avoir barboté dans un flacon laveur. Les microbes étrangers en suspension dans l’atmosphère sont retenus, soit par l’eau du flacon laveur, soit par la bourre de coton interposée entre ce dernier et le récipient, où se fait la culture. Les bacilles s'accumulent souvent en voile à la surface du bouillon, quand l’atmosphère, située au-dessus, est renouvelée. Après trois semaines, un mois au plus, les cultures sont suffisamment riches en toxine pour être employées; on les filtre sur une bougie Chamberland sous une pression de deux ou trois atmosphères, et le bouillon, chargé de toxines, est reçu à l’abri des germes de l’air, dans des flacons bien stérilisés; ces flacons, une fois bien remplis, sont bouchés et tenus à l’abri üe la lumiere, à la température ordinaire ; de la sorte, la toxine ne perd son activité que très lentement.

Il importe beaucoup de s’assurer de temps en temps, au cours des opérations précédentes, que le courant d’air passe régulièrement et lentement, sinon des accidents fort ennuyeux peuvent se produire ; la bourre de coton interposée peut être trop condensée, offrir ainsi une résistance trop grande au passage de l’air. Des lors, le vide se fait et il suffit alors de la pression extérieure, à peine égale à 1 atmosphère, pour écraser les ballons ; c’est ce qui s’est produit une fois au laboratoire de M. le professeur Arloing ; deux ballons s’affaissèrent subitement, au moment où l’on faisait passer le courant d’air; les cultures se répandirent dans l’étuve, ce qui nécessita une désinfection minutieuse. Pour éviter ces inconvénients, M. le professeur Arloing substitua des flacons de Mariotte couchés ou des vases a fond plat, aux grands ballons de Fernbach, moins résistants, et depuis lors, le même accident ne s’est plus reproduit.

Lorsque la toxine a été filtrée, il faut s’assurer de sa virulence ; elle doit tuer un cobaye de 500 grammes en quarante-huit heures à la dose de 1/10 de centimètre cube. Il importe également d’avoir fait une provision suffisante de toxine ayant la même activité ; de cette façon les expériences seront comparables entre elles. M. Roux faitremarquer, en effet, que tous les bacilles diphtéritiques, même lorsqu'ils paraissent également virulents pour les cobayes, ne donnent pas les mêmes quantités de toxine dans les cultures. Donc, on doit essayer des bacilles de diverses provenances, reconnaitre ceux qui sécrètent la toxine la plus active et, une fois la culture achevée, chercher également les flacons les plus toxiques. L'on a ainsi une ou deux sources de toxine à peu près également virulentes,

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CDR OE qu’on emploiera pour injecter un ou plusieurs chevaux. C'est là ce qui a été fait au laboratoire de M. le professeur Arloing ; touteslesinjections ont été faites avecdeuxtoxines désignées sous les rubriques, toxine À, toxine B, dont la virulence avait été exactement appréciée avant de commencer l’immunisationdes animaux. Cette immunisation est de beaucoup la phase la plus importante et la plus délicate dans la préparation du sérum ; c’est elle que nous avons

principalement en vue dans ce travail. Nous allons main-

tenant l’étudier, laissant, sous forme d’appendice, à la fin de ce travail les observations que nous devons à l’obligeance

de M. le professeur Arloing.

Immunisation des chevaux.

Avant d’injecter les chevaux, il est nécessaire de s’assurer qu'ils sont dans les meilleures conditions pour supporter l'infection à laquelle ils vont être soumis ; il n’est pas utile d’avoir des animaux de prix: des chevaux de fiacre ou de ferme suffisent très bien, pourvu qu’ils soient forts, robustes et qu’ils se nourrissent bien. Il importe beaucoup qu’ils n’aient aucune lésion des organes internes et surtout des reins ; les femelles pleines, ou qui ont mis bas depuis peu, sont moins résistantes à l’action du poison ; il ne faut donc pas les employer.

Avant toute chose, on doit s’assurer que les chevaux ne sont pas morveux et, par conséquent, qu'ils ne réagissent pas à la malléine, On leur injecte 3 centimètres cubes de malléine dans le tissu cellulaire lâche en arrière de l'épaule; on prend leur température avant l'injection et

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toutes les deux heures après. Il se développe généralement un peu de tuméfaction locale sans importance ; mais, il ne doit pas y avoir de forte réaction fébrile, sinon les chevaux sont suspects d'infection morveuse et ne doivent pas être employés.

D’après M. Roux, il en est de même des chevaux, qui ont eu auparavant une maladie infectieuse quelconque ; les cellules de l’organisme, qui ont été imprégnées de produits microbiens, ont acquis de ce fait une susceptibilité spéciale pour tous les agents infectieux. Lorsqu’on injecte de la toxine diphtéritique à un animal qui a déjà subi l'influence de quelque poison microbien, alors même qu'il paraît rétabli, il se montre beaucoup plus sensible que les animaux neufs; les faits qui confirment cette idée ne sont pas rares. M. Roux cite, notamment, l’histoire d’un cheval, qui s’est montré très sensible à l’action du poison diphtéritique ; il suffisait d’une injection d’un centimètre cube de toxine pure pour mettre la vie de l’animal en danger ; il se produisait une tuméfaction considérable, faisant place à une plaque indurée encore sensible aprèsune semaine; l’état général était très défectueux ; l'animal était abattu, ne mangeait pas et sa température atteignait 40°%5. M. Roux fait remarquer que ce cheval, un an avant d’être soumis à la toxine diphtéritique, avait été inoculé avec du pneumocoque de Talamon- Fraenkel très virulent et ces injections avaient provoqué une vive réaction ; c’est à ces inoculations que M. Roux attribue la sensibilité particulière de ce cheval pour le poison diphtéritique.

Il importe donc de bien examiner les chevaux pendant plusieurs jours avant de les inoculer ; dans le même ordre