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à 1.000 gr. du solvant, c’est donc la force ionique définie par Lewis.
b) En présence de faibles concentrations en C/Na : 1° la solubilité est indépendante de la phase saturante, 2° de la préparation.
log Se 0,9 V, Va Vu + log So S, — 0,3 pour 1.000 (par extrapolation).
KünnN et DESNOUELLE vérifient de la même façon que la partie protéidique du ferment jaune est un protéide pur (1).
SLOTTA et FRAENKEL-CONRAT trouvent, toujours par la même technique, que le protéide qu’ils obtiennent sous forme cristalline à partir du venin de serpent est une espèce chimique (2).
Ainsi, la connaissance des lois physico-chimiques de la solubilité des protéides peut apporter une aide précieuse aux chimistes en leur donnant un critère de pureté de ces substances. Et ceci montre que l'étude chimique ne doit pas précéder nécessairement l’étude physico-chimique des corps, et que l'inverse, dans bien des cas, peut conduire à des résultats plus rapides et plus féconds.
Influence du pH sur la solubilité.
La plupart des auteurs qui ont étudié la solubilité des protéides se sont surtout préoccupés de l'influence de la concentration en sels ou en protéides. Ils ont plus ou moins négligé le rôle de la concentration en ions hydrogène ou ne l'ont envisagé que dans des conditions assez particulières. Pourtant, dès 1905, MELLANBY (4) (5) attirait l’attention sur le rôle de l’acidité du milieu sur la précipitation de l’euglobuline (5).
) Küxn et DESNOUELLE, Ber. d. d. dem. Gs., 70, 1907 (1937).
)} SzorraA et FRAENKEL-COoNRAT, Ber. d. d. dem. Gs, 11, 1076 (1938).
) MEzLANBY, The Jour. of Physiol., 33, 338 (1905).
} MezLaAnBy, The Jour. of Physiol., 36, 288 (1907).
5) Mezcangy ne parle que de « globuline» mais il la définit comme étant un protéide insoluble dans l’eau et soluble dans des solutions salines diluées. C’est en réalité la définition actuelle de l’euglobuline.
Il constatait, en effet, que des solutions d’euglobuline dans des solutions salines diluées précipitaient par addition de différents acides. Ce résultat était obtenu en opérant de la facon suivante : il ajoutait aux solutions protéidiques des sels neutres jusqu’à début de précipitation, puis il acidifiait à l’aide de quantités variables d’un acide fort dilué. J’influence précipitante de l’acide était déterminée en dosant le protéide resté en solution. Il concluait de ses expériences que la teneur en ions H+ avait une influence sur la précipitation par les sels neutres surtout au voisinage du point isoélectrique.
Peu après, MicHaËLIs (1) (2) (3) et ses collaborateurs consacrent de nombreux travaux à une étude systématique de ce sujet ; mais il s’agissait pour eux de déterminer l'influence du pH sur la solubilité des protéides en labsence de sels neutres ou en présence de très faibles concentrations salines.
Malheureusement, certains protéides, les albumines par exemple, sont très solubles dans ces conditions quel que soit le pH. Il était donc nécessaire de diminuer leur solubilité soit en ajoutant une quantité donnée d’alcool, soit en dénaturant au préalable le protéide par la chaleur. Indépendamment de la complication introduite de cette facon dans l’interprétation des faits expérimentaux, les résultats obtenus étaient assez contradictoires, même dans les cas où la solubilité était suffisamment faible dans certaines régions de l'échelle des pH pour qu’il soit inutile de dénaturer le protéide ou d'ajouter de l’alcool (hémoglobine, globuline). De leurs premiers travaux, MiICHAËLIS et ses collaborateurs concluent que les protéides présentent un minimum de solubilité à leur point isoélectrique. Cette conclusion était basée, à vrai dire, sur des résultats obtenus à l’aide de méthodes expérimentales très critiquables — la solubilité, en particulier, était mesurée le plus souvent par de simples lectures d’opalescence ou de louche — et il serait préférable, en tout cas, de parler non pas d’une coïncidence entre le point iso-
(1, 2,3) MicuaELis et RoNA, Bioch. Zeutsch. 27, 838 (1910) 1 ; 28, 193 (1910) 2:
électrique et le minimum de solubilité, mais plutôt de la superposition d’une zone isoélectrique avec une zone de minimum de solubilité. D’ailleurs, les auteurs eux-mêmes remarquent, par la suite, que cette coïncidence n’est pas tout à fait constante : la présence de quantités d’électrolytes relativement très faibles suffisant à déplacer sensiblement le minimum de solubilité vers la région acide. Ce fait est, au surplus, fort difficile à interpréter car nous savons aujourd’hui que les électrolytes déplacent également le point isoélectrique. Quoi qu’il en soit, dans une première approximation, on peui admettre, comme conclusion de cés travaux que, en l’absence de sels ou en présence de traces de sels, les protéides présentent un minimum de solubilité au voisinage de leur point isoélectrique. Cependant, hâtons-nous de dire que la détermination d’un minimum de solubilité reste une technique inadéquate de la mesure du point isoélectrique.
SÔRENSEN et JYRGENSEN (1), CHicx et MARTIN (2) (3) observent des faits analogues toujours avec des protéides dénaturés par la chaleur. Puis CHIcKk (4) montre que l’euglobuline présente elle aussi un minimum de solubilité à son point isoélectrique (5). Mais on peut formuler sur ces expériences les mêmes critiques que sur celles de MicHAËLrs.
Récemment, GREEN (6) reprend la question au cours d’un important travail sur la solubilité de l’hémoglobine et de la caséine. Ceci le conduit à élaborer une théorie de la solubilité de ces substances en fonction du pH et pour de faibles concentrations salines. Sa théorie est essentiellement basée sur des considérations de force ionique et d’activité d’après l'hypothèse de DEeByE et Hücker. Les formules théoriques
(1) Sôrensen et JYRGENSEN, Bioch. Zeusch., 31, 397 (1911) (2) Caicx et MARTIN, The Jour. of Physiol., 45, 261 (1912). (3) Cæick et MarrTin, Bioch. Journ., 7, 380 (1913).
(4) Cmicx , Bioch. Journ., 7, 318 (1913).
(6) GREEN, Jour. of Biol. Chem., 93, 517 (1931).
ainsi obtenues donnent des valeurs numériques sensiblement comparables aux chiffres expérimentaux.
Le sujet dont nous nous occupons plus particulièrement, à savoir l'influence du pH sur la solubilité des protéides en présence de très fortes concentrations salines a été très peu étudié. Il n’y a guère que SÔRENSEN et GREEN qui se soient occupés de la question. Et encore ces auteurs n’ont étudié l'influence du pH que pour des variations restreintes de celui-ci. SÔRENSEN arrive à la conclusion que pour une concentration donnée en sulfate d’ammonium le logarithme de la solubilité est proportionnel au pH. Ainsi on obtient l'équation isotherme de solubilité complète de l’ovalbumine cristallisée :
log S — — 0,22 + 5,41 -- 1,7 (pa H — 4,90)
D'un point de vue théorique, elle est difficile à interpréter.
Quant à GREEN (1), il a étudié l’influence du pH sur la solubilité de la carboxyhémoglobine en présence de tampons de phosphates. Nous reviendrons d’ailleurs sur ce sujet dans la discussion des résultats expérimentaux.
Citons enfin les travaux de M. MACHEBŒUF (2) sur l’albumine du sérum. Cet auteur envisage la question sous un angle pratique : la séparation des protéides du sérum par les sels neutres. Ceci le conduit à étudier l’influence du pH sur la précipitation en présence de fortes concentrations en sulfate d’ammonium, et il observe que l’on peut précipiter totalement les albumines du sérum pour une concentration en sulfate d’ammonium à peine supérieure à la demie saturation si l’on amène la réaction du milieu au pH de 3,8.
S’inspirant de cette observation, SANDOR et BONNEFOI (3), puis SANDOR, BoNNEFOI et J.-J. PÉREZ (4) étudient l'influence du pH sur la précipitation des protéides sériques en présence de teneurs en sels très élevées. Ils notent deux accidents dans
)eLoc.tett 2p219;
) MaAcueBœur, Thèse de sciences, Paris, 1928. ) Sanpor et Bonneror, Bull. Soc. Chim. Biol.
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la courbe de solubilité des albumines et un seul dans celle des globulines. Ces résultats ne constituaient qu’une première approximation car ces auteurs avaient négligé certains facteurs qui, au premier abord, leur avaient paru négligeables et ne l’étaient pas en réalité. C’est le cas, notamment, des ions sulfates apportés dans lies solutions par l’acide sulfurique ajouté pour augmenter la concentration en ions hydrogène et qui modifiaient, en même temps, la teneur en ions
sulfates et la force ionique.
Ce bref résumé historique montre que de nombreux auteurs ont compris l’intérêt théorique et pratique que présente l'étude de la solubilité des protéides ; maïs, dans la recherche d’une formule de solubilité, s’ils ont envisagé l’influence de certains facteurs physiques avec le plus grand soin, ils n’ont pas cherché à approfondir le rôle du pH, sauf pour de faibles concentrations salines ou dans des conditions un peu particulières. Les seuls auteurs qui aient vraiment abordé la question sont SÔRENSEN et GREEN, mais ils n’ont étudié linfluence du pH en présence de fortes concentrations salines que pour de faibles variations de celui-ci.
Cependant, il nous est apparu qu’une théorie complète de la solubilité des protéides ne saurait être élaborée sans que soit résolu ce problème. Avant donc d’entreprendre la discussion des travaux précédents, nous avons cru devoir chercher à le résoudre : c’est ce qui fera l’objet des pages sui-
vantes.
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Travaux personnels.
(Influence du pH sur la solubilité des protéides sériques
J 4 2 t A| 7 £ en présence e concentrations salines élevées).
Techniques générales.
Les déterminations de solubilité de ce travail ont porté exclusivement sur les protéides du sérum de cheval. Ces protéides présentent l’avantage de pouvoir être obtenus facilement en quantités importantes, leur concentration dans le sérum étant relativement élevée. D’autre part, à l’état naturel, ils existent sous forme de solution ; après leur isolement, ils sont encore très solubles et conviennent donc parfaitement à des études de solubilité.
Les meilleures méthodes d'isolement des protéides du sérum reposent sur leur insolubilisation par les sels neutres. Vers le milieu du siècle dernier, PANUM, VIRCHOW et CLAUDE BERNARD avaient déjà utilisé cette propriété (1) ; mais c’est seulement après les travaux de HoFMEISTER, en 1887-1888, que la méthode devint classique. Elle est employée encore aujourd’hui presque sans modifications.
Il est à remarquer que les protéides isolés par cette méthode sont définis seulement par leur préparation et nous ignorons si nous nous trouvons en présence d’espèces chimiques ou de mélanges. Dans ce cas, la composition de ces mélanges peut varier avec les conditions d'isolement.
Pour que les produits isolés soient comparables à euxmêmes, il est donc indispensable que les conditions de leur préparation soient rigoureusement fixées.
(1) Voir p. 7.
Préparation du matériel.
La technique adoptée pour la séparation des protéides du sérum s’appuie sur leur différence de solubilité en présence du sulfate d’ammonium : les globulines sont insolubles dans les solutions à demi-saturées en sulfate d’ammonium : les albumines sont insolubles seulement quand la concentration atteint la saturation. On peut d’ailleurs, comme l’a montré M. MAcHEBœur (1), précipiter totalement les albumines pour une concentration en sulfate d’ammonium à peine supérieure à la demi-saturation si on amène le pH de la solution à 3,8. On peut, enfin, séparer les globulines en deux fractions : les euglobulines insolubles dans l’eau pure et les pseudoglobulines solubles dans l’eau pure.
A. — Globulines.
A un volume déterminé de sérum de cheval, on ajoute un volume égal d’une solution saturée et neutre de sulfate d’ammonium (2). Les globulines précipitent. On laisse reposer une demi-heure puis on centrifuge énergiquement. Les eauxmères sont recueillies : elles seront utilisées ultérieurement pour la préparation des ailbumines. Le précipité de globulines est dissous dans une quantité d’eau distillée égale aux deux tiers du volume du sérum utilisé. Pour purifier les globulines, on les précipite une seconde fois de cette solution en ajoutant une quantité de la solution saturée de sulfate d’ammonium égale au volume d’eau distillée qui a été utilisé pour les dissoudre. Le précipité formé est recueilli comme précédemment, dissous dans l’eau et précipité une troisième fois.
Après ces trois précipitations successives, les globulines sont dissoutes dans l’eau distillée.
(1) Macuesœur, Thèse de sciences, Paris, 1928:
(2) Le sulfate d’ammonium utilisé a toujours été purifié par deux cristallisations successives. Avant la première cristallisation, la solution bouillante était additionnée d’ammoniaque et filtrée pour éliminer les traces de fer que le sel aurait pu contenir.
