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Point isoïonique.
Quelques considérations théoriques sont ici indispensables pour faire comprendre la méthode de mesure du point isoionique que nous avons eu contamment à utiliser au cours de ce travail.
Le point isoïionique d’un ampholyte est un point critique dans l'échelle des pH pour lequel cet ampholyte n’émet et n’absorbe pas d'ions hydrogène (1). Le pH d’une solution aqueuse d’un protéide rigoureusement pur devrait, pratiquement, coïncider avec son point isoïionique (2).
La détermination du point isoïionique d’un protéide serait donc très simple s’il était possible d’obtenir ce protéide à l'état pur. Mais ce n’est pas le cas. Les protéides retiennent avec une grande énergie de nombreuses impuretés et, en particulier, des acides ou des alcalis suivant qu’ils se trouvent au-dessus ou au-dessous de leur point isoïonique.
La présence de ces impuretés ioniques entraîne un déplacement de la valeur du pH qu’aurait la solution protéidique si elle était pure. Pour mesurer le point isoïonique, il faut donc mesurer la quantité d’acide ou d’alcali fixée par le protéide, calculer le changement de pH que peut introduire cette quantité d’acide ou d’alcali dans un volume donné de la solution protéidique et retrancher ou ajouter cette valeur à celle du pH mesuré. Plus simplement, la quantité d’acide ou d’alcali retenus par un volume déterminé de la solution protéidique étant connue, on ajoute à un même volume de la solution la quantité d’alcali ou d’acide juste nécessaire pour neutraliser l’acide ou l’alcali retenus par le protéide. Le pH de la solution est alors le point isoïonique du protéide.
Pratiquement, il est plus facile de doser un alcali retenu par
(1) SÔRENSEN, C. R. Lab. Carlsberg, XIX, 11, 1927.
(2} En effet, la différence entre le point isoionique et le pA de la solution protéidique pure est égale au changement de pH que peut provoquer dans le volume d’eau qui dissout le protéide, la quantité d’acide ou de base nécessaires pour amener cette eau au pA du point isoionique du protéide. Or, pour une concentration suffisante du protéide, cette quantité est infime et, pratiquement, le point isoionique et le pA de la solution protéidique pure coïncident. G. Sanpor, Bull. Soc. Ch. Biol., XVIII, 877, 1936.
DÉTRIS -RER
le protéide qu’un acide retenu par ce même protéide parce que le cation de l’alcali se retrouve dans les cendres après incinération tandis que la plupart des anions sont complètement détruits ou éliminés (1). Les protéides sont donc transformés en protéidates de sodium purs. La détermination du
point isoionique comporte finalement les opérations suivantes :
1° Remplacement des cations par le cation sodium seul ;
2° Elimination des anions ;
3° Dosage de la soude retenue par le protéide, neutralisation de cette soude et mesure du pH après la neutralisation,
Les opérations (1) et (2) se font, nous l’avons vu, en dialysant la solution protéidique d’abord contre une solution à 1 % de sulfate de sodium, puis contre de l’eau distillée. On s’assure de l’élimination complète de l’anion sulfate en ajoutant une goutte d’une solution de chlorure de baryum à 10% à une petite partie de la solution protéidique.
Le dosage du sodium est fait par pesée après calcination et transformation en sulfate de sodium. Pour cela, un volume connu de la solution protéidique est évaporé à sec dans une capsule de platine tarée et le résidu est calciné dans un four à moufle. Si les cendres obtenues ne sont pas parfaitement blanches, on ajoute quelques gouttes d’acide nitrique, on évapore et calcine une seconde fois. On verse ensuite sur les cendres deux à trois gouttes d’acide sulfurique pur, évapore au bain d’air et calcine quelques instants sur un bec Bunsen. Enfin, pour transformer le sulfate acide de sodium qui a pu se former, en sulfate neutre, on ajoute du bicarbonate d’ammonium, évapore, calcine et pèse le sulfate de sodium neutre contenu dans la capsule. Connaissant la quantité de sodium et, par suite, celle de soude contenue dans un volume donné
(1) G. S. Anaïr et M. E. Aparr, The Bioch. Journ., 28, 1934, p. 1230. Ces auteurs, qui déterminent le point isoïonique par des mesures de potentiel de membrane, dosent le CO? fixé par le protéide au lieu de doser le Na comme nous le faisons ici. Ils éliminaient au préalable les bases combinées au protéide par dialyse contre de l’eau distillée puis contre de l’eau contenant du CO?. Cependant, cette technique n’est applicable qu’au cas particulier de l’hémoglobine.
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de la solution, il suffira donc de prélever une portion aliquote de cette solution, de lui ajouter une quantité d’acide sulfurique équivalente à la quantité de soude qu’elle contient et de mesurer le pH. Le pH mesuré est, nous l’avons vu, la valeur du point isoïonique du protéide.
La quantité de sodium retenue par le protéide étant relativement faible, il faut incinérer des quantités assez importantes de protéides pour avoir un poids de cendres suffisant. C’est-à-dire qu’il faut utiliser des solutions dont la concentration en protéides soit au moins égale à 2 % et en prélever 10 cm°. Il est d’ailleurs facile d’obtenir des solutions de cette concentration en dialysant sous pression. Nous avons même pu, par ce procédé, atteindre des concentrations de 15 %.
Note sur le point isoionique.
Au début de ces études de solubilité, nous avions cherché à mesurer le point isoionique par une méthode un peu différente dérivée de la méthode originale de MicaËzis. Dire qu’une substance est capable d’émettre ou d’absorber des ions H+, c’est dire que cette substance est un tampon. L’effet tampon dépend lui-même de la quantité d'ions H+ que la substance peut émettre ou fixer dans des conditions données. Par suite, le point isoïonique sera la valeur du pH pour laquelle l’effet tampon d’un ampholyte passe par zéro, ou, si l’on préfère, change de signe. Si donc, avec les mêmes axes de coordonnées, on trace la courbe de titrage de l’eau distillée et celle d’une solution aqueuse pure d’un protéide, le point d’intersection de ces deux courbes se fait pour une valeur des ordonnées égale au pH du point isoïonique puisque c’est à l’intersection de ces deux courbes que l'effet tampon passe par zéro (1). Cette méthode présente d’ailleurs la même cause d’erreur que la précédente : les impuretés retenues par les protéides déplacent:les courbes de titrage et les intersections ne correspondent pas au point isoïonique. SÔRENSEN éliminait cette cause d'erreur en dosant exacte-
(1) L’effet tampon a, en gros, pour valeur la différence des ordonnées de la courbe de titrage du protéide et de celle de l’eau distillée pour une même valeur de l’abscisse.
ment les différents ions diffusibles contenus dans les solutions protéidiques.
Cette méthode est d’une application délicate. SANpoRr (1), pour la simplifier, transformait le protéide en protéidate de sodium, dosait le sodium et calculait la valeur du déplacement de la courbe parallèlement à l’axe des abscisses produit par la présence du sodium. La courbe ainsi déplacée coupait célle de l’eau distillée au point isoionique. La seule différence avec la technique de SôRENSEN était, en somme, qu’il suffisait de doser un seul ion, le sodium.
Etude de la solubilité.
On trouvera dans ce chapitre la description de la technique générale qui a été employée ; mais, dans le compte rendu des expériences, nous aurons à signaler de nombreuses modifications à cette technique ; modifications imposées par la diversité du matériel étudié.
La solubilité d’une substance dépend d’un certain nombre de facteurs. Pour déterminer l’influence de l’un d’eux sur la solubilité, il faut maintenir tous ces facteurs constants sauf celui dont on veut étudier l'influence. Pratiquement, il s’agit de réaliser une série de mélanges placés dans les mêmes conditions et ne différant les uns des autres que par la valeur du facteur à étudier. La réalisation de ces conditions n’est d'ailleurs pas toujours rigoureusement possible.
Les principaux facteurs qui interviennent dans la solubilité aqueuse des protéides en présence des sels neutres sont :
la température,
la concentration en sels,
la concentration en protéides,
la concentration en ions hydrogène,
le temps.
La technique primitivement utilisée — portant exclusivement sur les globulines — était relativement simple. La
(1) Bulletin de la Société de Chimie biologique, XVIII, 877 (1936).
