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solution de globulines, obtenue cemme il a été indiqué (page 23), n’était pas dialysée, elle renfermait donc une quantité importante de sulfate d’ammonium, quantité mesurée directement par pesée de l’anion S0*——- à l’état de sulfate de baryum. On mesurait d’abord les variations du pH de ces solutions en fonction de volumes variables d’acide sulfurique N/5 ajouté à une portion aliquote (1). Puis à des portions aliquotes de la solution, on ajoutait des volumes variables d'acide sulfurique N/5 contenant du sulfate d’ammonium au quart de saturation (2) et toutes les prises étaient complétées au même volume par une solution de sulfate d’ammonium au quart de saturation. Les précipités formés étaient re-. cueillis par centrifugation au bout de dix minutes et leur azote protéidique dosé. Pour ce faire, on les dissolvait dans l’eau distillée, puis on les précipitait cinq fois de suite par l'acide trichloracétique pour éliminer le sulfate d’ammonium, l’azote était enfin dosé par la micro-méthode de KJEt- DAHL (3).

Cette technique, quoique donnant déjà des résultats intéressants, prêtait à de nombreuses critiques. En particulier, la présence du sulfate d’ammonium ne permettait pas de remonter suffisamment haut dans l'échelle des pH parce que PNH* de ce sel est déplacé et se dégage à l’état gazeux quand la réaction du milieu devient alcaline. Ce fait entraîne une modification continuelle du pH au cours de la mesure et une variation de la concentration en sulfate d’ammonium dans les mélanges où l’on étudie la solubilité. Or, la concentration en ce sel doit être la même dans les différents mélanges et le pH de chacun d’eux doit être rigoureusement fixe.

Nous avons alors remplacé le sulfate d’ammonium par le sulfate de sodium qui n’est tampon dans aucune région de l'échelle des pH et possède une base fixe.

La technique était presque identique à la précédente en ce

(1) La solution de globulines utilisée pour ce titrage avait la même concentration en protéides et sulfate d’ammonium que dans celle utilisée pour l’étude de la solubilité. L’acide sulfurique N/5 contenait du sulfate d’ammonium à la même concentration.

(2) La solution de globulines contenait en effet ce sel à cette concentration.

(3) Sanpor, Bonwerot, PÉREZ, C. R. Ac. Sc., 1254 (1933).

qui concerne la réalisation des mélanges et les dosages d'azote précipité par l’acide trichloracétique.

La principale modification portait sur l'isolement des protéides du sérum qui étaient précipités par le sulfate de sodium suivant une technique proposée par Howe (1). Les résultats obtenus étaient comparables aux précédents et donnaient la solubilité des globulines en présence du sulfate de sodium pour des valeurs du pH allant de 3,5 à 8,5.

Dans toutes ces expériences, on ne mesurait pas, à vrai dire, la solubilité, mais en réalité la précipitation. La solubilité était calculée en retranchant la quantité de globulines précipitées de la quantité de globulines avant la précipitation. Cette facon de procéder était peu précise : on ne dosait pas seulement les globulines précipitées, mais encore celles de la solution restée adhérente au tube de centrifugeuse et surtout celles de la solution retenue dans le précipité. L’inconvénient ne serait pas grave si la quantité retenue était toujours la même ou si elle était proportionnelle au volume du précipité, mais elle dépend encore de la structure physique du précipité et de la viscosité de la solution. Or, la structure du précipité et la viscosité varient avec la réaction du milieu.

Enfin, l’évaluation des pH des différents échantillons par comparaison avec la courbe de titrage était défectueuse. D’abord, parce que la quantité d’acide ou d’alcali ajoutée à lun des échantillons pouvait ne pas être rigoureusement la même que celle de la courbe de titrage (2), et ensuite parce que la précipitation peut modifier la concentration en ions H+.

Pour éviter ces causes d'erreurs, il fallait donc mesurer directement la concentration en protéides et la concentration en ions hydrogène de chaque échantillon après la précipitation. La solution étant saturée en protéides (puisque en présence de son précipité), on mesurait ainsi exactement la solubilité des protéides pour un pH déterminé.

(1) Howe, The Jour. of Biol. Chem., 49, p. 93 (1921).

(2) Cette cause d’erreur est importante quand le protéide se trouve au voisinage de son point isoélectrique. Il n’est pas tampon dans cette région et de faibles quantités d’acide font varier énormément son pH.

Après ces modifications, les courbes de solubilité obtenues, sans contredire les premières observations, étaient beaucoup plus régulières.

Il restait encore cependant une grave cause d’erreur. Nous lavions envisagée dès le début de ces recherches ; mais elle nous avait paru négligeable et nous n’avions pas cru devoir en tenir compte. Cette cause d'erreur est la suivante : pour augmenter la concentration en ions A+, on ajoute de l’acide sulfurique. Or l’addition de cet acide n’apporte pas seulement des ions H+ ; mais encore des ions SO‘——. A première vue, la variation de la teneur en ions SO*—— ayant cette origine nous avait semblé pouvoir être négligée par rapport à l'énorme quantité apportée par le sulfate de sodium. En fait, il n’en était rien et quelques irrégularités des courbes de solubilité disparurent quand nous fimes les précipitations avec une concentration en ions SO0‘—— rigoureusement constante. Ceci s'explique probablement par le fait que les ions SO‘—-— apportés par l’acide sulfurique n’agissent pas simplement par action de masse — ce qui serait sans doute négligeable — mais encore en modifiant la force ionique des solutions, et la force ionique a, dans certains cas, une influence énorme sur la solubilité.

La technique utilisée était finalement la suivante :

Avec une portion aliquote de la solution protéidique, on étudie les variations du pH en fonction des quantités d’acide sulfurique titré ou de soude titrée ajoutées à cette solution. La courbe de titrage ainsi obtenue permet de savoir approximativement les quantités d’acide ou de soude qu’il faut ajouter aux différentes prises d’essai pour obtenir les pH désirés. On préparait alors une série de mélanges de même volume établis de la facon suivante :

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Ces chiffres ne sont évidemment donnés qu’à titre d’exemple : les proportions d’acide, de base, de solution protéidique, etc, de même que le volume final des mélanges pouvaient être très variables.

Quoi qu’il en soit, ces mélanges ont la même force ionique, la même concentration en protéides, en sels, en ions sulfate. Toutefois, la concentration en cations sodium n’est pas rigoureusement constante ; mais, pour les mélanges de la première série — qui constitueront d’ailleurs la majorité des points de la courbe de solubilité — la variation de la concentration en cations Na+ est compensée par une variation inverse et exactement équivalente en cations H+. Et ainsi, la concentration totale en ions et la force ionique ne varient pas. Dans les mélanges de la seconde série — qui ne constitueront généralement qu’un point extrême de la courbe — la variation de la teneur en cations Na+, apportés par la soude, n’est pas compensée par celle des cations H+, ce qui entraînera une variation — d’ailleurs infime — de la force ionique d’un point de la courbe de solubilité. Cette variation est impossible à éviter si l’on veut maintenir la concentration en anions sulfate rigoureusement constante. Enfin, le pH variait dans de larges limites.

Pour réaliser ces mélanges, on dissolvait d’abord le sulfate de Na placé dans un tube de centrifugeuse à l’aide de la solution N/20 de sulfate de Na et de l’acide titré (ou de la soude) ; les tubes étaient ensuite maintenus dans un bainmarie à 33° pour rendre la dissolution plus rapide. La dissolution achevée, les tubes bien bouchés étaient abandonnés au moins douze heures au laboratoire pour que l’équilibre de température soit parfaitement atteint. On ajoutait alors la solution protéidique, également à la température du laboratoire, en agitant continuellement pour que le mélange ne cesse, dans la mesure du possible, d’être homogène. Tous les mélanges étaient abandonnées un même temps, puis centri-

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fugés dix minutes et décantés aussitôt après la centrifugation. On mesurait immédiatement la concentration en ions hydrogène des liquides décantés et leur teneur en azote par les méthodes que nous avons indiquées plus haut.

La description d’une expérience fera mieux comprendre la marche suivie.

Protocole d’une expérience.

La solution de protéides préparée et dialysée comme nous l'avons vu (p. 23) est centrifugée énergiquement au moment de l'emploi pour éliminer toute trace de protéides dénaturés. Puis, on la recueille dans une fiole de quartz stérilisée (1).

1° Titrage potentiométrique de la solution.

A un centimètre cube de cette solution, on ajoute 2 cm’ d’eau distillée, puis de l'acide sulfurique N/40 par fractions de 0,20 cm*. On note après chaque addition d’acide le voltage de la solution. On répète la même opération avec de la soude N/40 et on dresse une courbe en portant les volumes d’acide ou de soude en abscisses et les voltages en ordonnées. On obtient la courbe de la figure 1.

2° Concentration en protéides de la solution.

On évapore 4 cm de la solution dans une capsule de platine, au bain-marie, puis on porte à l’étuve à 110° jusqu’à poids constant et on pèse.

Poids de substance sèche 0,4155. La concentration en protéides de la solution est donc :

(1) Les vases de silice sont indispensables lorsqu'il s’agit de protéides complètement dialysés. En effet, les cations contenus dans les récipients de verre se dissolvent dans la solution protéidique et en modifient continuellement le pI1.

htm us: “be. si

FiG. 1. — Courbe de titrage d’un protéide (pseudoglobulines).

3° Détermination du point isoionique.

La substance sèche contenue dans la capsule de platine est calcinée au four à moufle. Si cette calcination ne permet pas d'obtenir des cendres blanches, on ajoute quelques gouttes d'acide nitrique et on calcine une seconde fois. Aux cendres blanches obtenues, on ajoute quelques gouttes d'acide sulfurique pur, on évapore au baïn d’air et on calcine quelques instants au rouge sombre. On répète une fois cette opération. On ajoute enfin un peu d’eau et quelques cristaux de bicarbonate d’ammonium, on évapore au baïin-marie (1), on calcine avec précaution et on pèse le sulfate de sodium neutre contenu dans la capsule :

DOS AO ONE 5er ee ae 1 mgr. 8

Une solution vingtième normale de sulfate de sodium renferme 3,55 gr. de ce sel au litre ; soit donc 3,55 mgr. dans 1 cm:.

(1) Une dessiccation complète est indispensable pour éviter les déflagrations pendant la calcination. Il est donc préférable, après évaporation au bain-marie, de porter 12 h. à l’étuve à 1109 avant de calciner.

DRE Es 1,8 mgr. de sulfate de sodium correspondent par suite à :

Su = 0,507 cm* de solution N/20 de sulfate de sodium

ou de soude.

On prend 4 cm° de la solution protéidique, on lui ajoute 0,507 cm° de SO‘H? N/20 et on mesure le pH.