EXTRACTION

On prépare done une grande quantité de jus par infusion au 1/5 de la poudre. On le filtre et on l’épuise au moyen d’éther sulfurique en milieu normal. Cet extrait éthéré a une couleur jaune verdâtre due à la chlorophylle. On distille alors l’éther dans un ballon muni d’un réfrigérant en s’aidant du vide. La distillation est poussée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de traces d’éther (au besoin on place 24 h. à létuve). On reprend le résidu par de l’eau distillée légèrement alcalinisée et tiède. On agite bien et on recommence plusieurs fois l'opération. Notre principe soluble en milieu alcalin doit passer dans l’eau. On réunit les différentes portions qu’on filtre sur talc pour retenir la chlorophylle. À ce moment, nous réacidifions le filtrat obtenu avec HCI au demi pour pouvoir le réépuiser à l’éther. Quand nous ajoutons l’acide goutte à goutte, il se forme un précipité d’une couleur jaune sale. S'agit-il d’un acide ou d’un phénol, car l’eau alcalinisée à la soude peut dissoudre non seulement un acide sous forme de sel soluble, mais encore un phénol à l’état de phénate. On agite donc ce précipité à l’éther, le précipité s’y dissout. Après l’avoir bien épuisé avec l’éther, on distille ce dernier, on concentre à 3 ou 4 cc. qu’on recueille dans un tube stérile. On finit par les évaporer au B.M. et l’on met 24 heures à l’étuve. On constate la présence d’un précipité au fond du tube qu’on reprend avec de l’eau distillée stérile qu’on neutralise. On a repris avec une quantité d’eau qui se trouve dans le rapport de 1 pour 100 cc. de jus. On fait une expérience sur boîte de Pétri au moyen d’un Staphylocoque pénicillinorésistant d’après la méthode de Heatley, expérience dont on se resservira par la suite. On verse 2 gouttes de la solution dans le godet de droite (a), 2 gouttes de solution diluée avec 1/3 d’eau stérile dans le godet de gauche (b), et 2 gouttes de solution diluée à 1/2 dans le godet du bas (c). Dans le godet du haut (d), on ajoute 2 gouttes d’une solution de Pénicilline titrant 400 U.O. par cc. On dispose la boîte 24 heures à l’étuve. Comme le montre la photographie cidessous, la solution est active sur un germe pénicillinorésistant (zones claires autour des godets). Fig. 4 Malheureusement la chlorophylle que l’on croyait éliminée est toujours présente, témoins ces zones de diffusion vertes, foncées sur la photographie, au delà des zones claires inhibées.

(Fig. 4 (reproduction de la boîte)

Elimination de la chlorophylle et d’autres pigments présents.

Nous savons que le charbon animal activé retient les pigments des plantes à savoir chlorophylle, xantophylle, carotène; malheureusement il retient aussi d’autres substances, comme nous avons pu le constater dans un premier essai d'extraction. Mais ces pigments sont solubles dans l’alcool fort et dans l’éther et c’est par ces deux solvants que nous allons les éliminer.

Le précipité qu’on a dissout dans l’eau et neutralisé pour faire l’essai sur boîte de Pétri, est régénéré par acidification à l’'HCI. On filtre le tout sur papier filtre. Le précipité resté sur le filtre est lavé avec de l’alcool à 96° et on obtient un filtrat d’un beau vert. Les 3 pigments ont filtré. On lave encore deux ou trois fois le précipité à l’alcool fort pour entraîner les traces de pigments restants. Le résidu est repris par une solution alcaline au bicarbonate de soude, qui après

agitation dissout notre précipité; par 1 ou 2 gouttes d'HCI nous éliminons CO.. Il se confirme que nous sommes donc bien en présence d’un acide, car si la partie active était un phénol, ce dernier ne se serait pas dissout dans une liqueur bicarbonatée. La solution est alors agitée avec de léther. Rien ne doit passer dans l’éther si ce ne sont les toutes dernières ‘races de pigments qui n’ont pas été enlevées par de l’alcool. On décante l’éther et on conserve la couche aqueuse.

Obtention du principe actif en solution.

La solution aqueuse est acidifiée. Au fur et à mesure que les gouttes d'HCI tombent dans le liquide, il se forme un précipité jaune orangé. On agite le tout avec de l’éther, le précipité repasse en solution dans l’éther, on décante, on chasse l’éther et les 3 derniers centimètres cubes sont évaporés dans un tube stérile. Après 24 heures de séjour à l’étuve, on reprend le résidu avec 6 cc. d’eau distillée stérile (1 cc. pour 100 cc. d’infusion). Le précipité ne se dissout pas; après vérification du Ph, ce dernier est acide, on neutralise donc avec de la soude à 5%, à ce moment le précipité se dissout. Cette neutralisation nous est d’ailleurs nécessaire pour pouvoir faire nos essais sur les microbes.