CONTROLE DE L’EFFET ANTIBIOTIQUE

Méthodes employées.

2 procédés: les méthodes de Vitastain et de Heatley ont été utilisées pour contrôler l'effet antibiotique.

Méthode de Vitastain.

Elle est basée sur la coloration rouge que prend une goutte de solution de triphényltétrazoliumchlorid ou colorant vital au contact de cellules en prolifération.

En employant le Bacille subtilis, cette méthode exige un milieu spécial pour le cultiver. Comme nous voulons contrôler l’activité antibiotique de notre substance sur le Staphylocoque doré, le Bacille subtilis, le Colibacille et le Bacille pyocyanique, nous avons employé un seul et même milieu

solide convenant aux 4 microbes et dont l? composition est la suivante:

(DiGélésens. Nr Abe 20 gr. (2) Bouillon ordinaire Chlorure de sodium 3 gr. 900 gr.

Extrait de viande .. 3gr. (employé pour la culture

Eau ordinaire ..... 500 gr. du Staphylocoque)

On fait gonfler la gélose dans l’eau, on ajoute le sel et extrait de viande et on fait dissoudre le tout dans l’autoclave, à la vapeur fluente. Quand la dissolution est réalisée, on mélange (1) et (2). On stérilise 15 minutes à 120°. Ce milieu est utilisé et pour la méthode de Vitastain et pour celle de Heatley.

On prépare des tubes à hémolyse et en même temps on fait liquéfier un peu du milieu précédent dans un B.M. bouillant. Quand il est parfaitement liquide, on le transporte dans un autre B.M., dont la température est maintenue à 43°. Le milieu restera liquide. Une culture de Bacille subtilis de 24 heures sur milieu solide identique à celui décrit ci-dessus est alors émulsionnée dans du sérum physiologique et ajoutée au milieu liquide maintenu à 43°. On agite bien pour obtenir une bonne répartition du Bacille subtilis dans tout le milieu. Puis on distribue le milieu ensemencé dans les tubes à hémolyse à raison de 1 cc. par tube. On bouche, on met à l’étuve, Après 6 heures de séjour, durée ayant permis au Bacille subtilis de se développer suffisamment, on ajoute dans les tubes à la surface de contact du milieu 1 goutte des solutions à essayer en l’occurence pour notre expérience, 1 goutte des dilutions suivantes:

On replace à l’étuve et au bout de 15 heures on ajoute 1 goutte de colorant vital par tube. Au bout de quelques minutes, nous voyons apparaître des colorations rouges à la surface, dans les tubes où le Bacille subtilis a continué à proliférer; dans ceux où sa croissance a été inhibée, l’indicateur incolore ne vire pas. D’après les observations, nous constatons que 1/20 1/10 1/5 17255 1/1 T . ++ - — — +

dans les 2 premiers tubes l’an‘ibiotique est à une dilution ne lui permettant plus aucune action. En comparant ce tableau au résultat obtenu avant la purification de notre substance, il apparaît que l’activité a un peu diminué, mais elle est encore assez efficace.

Méthode de Heatley.

Dans 4 boîtes de Pétri stérilisées au four Pasteur, nous coulons stérilement une couche de milieu liquéfié non ensemencé. On laisse la solidification s’opérer et lon dispose les boîtes à l’étuve, pendant 3 heures, en ayant soin de les retourner, pour que l’eau puisse s’évaporer. Durant ceîte période, on liquéfie le milieu, on le maintient à 43° au B.M.

et on l’ensemence avec une culture liquide âgée de 24 heures de Staphylocoque doré pénicillinorésistant. Cette opération est répétée pour le Bacille subtilis, le Colibacille et le Bacille pyocyanique. Puis on répartit les 4 milieux ensemencés à raison de 3 cc. par boîte, en une mince pellicule à la surface du milieu solide. On laisse refroidir. Quand le contenu des boîtes s’est pris en masse, on fixe à la surface de la gélose des cylindres stérilisés, soit au four Pasteur, soit à la flamme. On ajoute ensuite 2 gouttes de notre solution dans un cylindre et une dilution de Pénicilline dans l’autre. On répète cette opération pour les 2 cylindres de chacune des 3 autres boîtes. Puis on dispose les 4 boîtes à la glacière pendant 3 heures pour laisser la diffusion se faire et ensuite 24 heures à l’étuve à 37°, excepté le Pyocyanique, qui est placé à 24°. Au bout des 24 heures, nous constatons les faits suivants: 1° Staphylocoque pénicillinorésistant: la zone d’inhibition est légèrement inférieure à celle obtenue dans lexpérience précédente (ce fait a déjà été clair dans la méthode de Vitastain). La Pénicilline n’a aucune action. 2° Bacille subtilis: il existe une zone d’inhibition nette pourtant inférieure à celle obtenue avec le Staphylocoque.

3° Bacille coli et Bacille pyocyanique: on ne peut pas parler d’une activité vraiment antibiotique. Néanmoins, l’action est plus marquée pour le Bacille coli que pour le Bacille pyocyanique.

Conclusion.

Par la purification, l'extrait perd un tant soit peu de son activité antibiotique. Il se peut que cette diminution provienne de la chlorophylle éliminée ou de la purification. En effet, les solvants (l’eau, l’alcool!l fort, l’éther) ou la filtration sur talc peuvent avoir retenu une partie de la substance active.

Au contraire, nous avons maintenant un produit relativement pur et dont l’action inhibitrice est nettement définissable et va même jusqu’à s'exercer sur un germe pénicillinorésistant.

Définition de l’activité antibiotique de notre substance.

Cette dernière a été définie par rapport à la Pénicilline sur une souche de Staphylocoque pénicillinosensible.

Nous avons, en effet, obtenu avec notre solution une zone d’inhibition sensiblement équivalente à celle réalisée avec une dilution de Pénicilline à 10 U.O. par ce.

RW

Il s’en suit que notre extrait concentré au 1/100 par rapport à l’infusion titre 10 U.O. par centimètre cube, ce qui correspond à 0,5 U.O. par gramme de poudre de feuille ou par cc. de jus extrait de la feuille fraiche.