ÉTUDES DE QUELQUES PIGMENTS BACTÉRIENS
LPICMENTESECRÉTÉ PAR LESPACILEER POLYGHROME
Dans un remarquable travail THIRY (1900) a étudié une Bactérie connue sous le nom de Bacille polychrome sur laquelle nous allons nous arrêter, car elle présente un très haut intérêt pour la Biologie générale, montrant combien un agent chromogène peut être susceptible de variation dans son activité.
B. polychromogenes donne, sur pomme de terre, des résultats très variables. Ainsi, sur un même tube de pomme de terre, lorsque l’ensemencement a été effectué de façon à isoler les colonies, G. THIRY a observé des colonies « violettes, violet noir, Indigo bleu, vertes, orange, jaune citron, jaune or, jaune vert, ocre rouille, roses, rouges, grises, bistre, marron, chamois, etc. Ces colomes s’entourent ou non d’une auréolé colorée en bleu, bleu indigo, vert, violet, rouge ou rosé. »
Sur gélatine peptone ce Bacille polychrome donne un pigment vert émeraude. Sur gélatine bouillon le pigment qui diffuse dans la masse est rouge vif.
Dans une culture de Bacille polychrome on peut observer des éléments colorés en rouge ou en bleu dont la coloration est localisée ou diffuse; le plus généralement le Bacille est incolore. Chez les germes colorés le COrps bacillaire peut être uniformément et totalement coloré ou présenter deux grosses granulations bleu indigo foncé.
Un Bacille divisé par un étranglement peut montrer une moitié colorée
(1) Au cours de ce chapitre seront relatées les expériences de Ph. LAssEUR et F. GIRARDET pour caractériser les pigments par leur spectre d'absorption. Nous prions le lecteur de se reporter aux spectrogrammes que nous avons reproduits à la fin de ce volume et que nous avons extraits des publications de ces deux auteurs.
= rÈeS
en bleu, l’autre moitié colorée en rouge ou bien une colorée et l’autre in-
colore.
Conditions de production du pigment
La lumière ne paraît pas nécessaire à la coloration des cultures. Par contre, l’accès de l’air est indispensable. La pigmentation exigeant un optimum de température compris entre 10° et 20° C. peut encore se manifester à des températures plus basses, mais ne se produit pas à 37° C.
Solubilité du pigment
Le pigment est très soluble à froid dans l’eau distillée, l’eau chloroformée, camphrée, thymolisée.
Soluble dans l’alcool dilué et concentré, en gardant sa teinte primitive si l’alcool n’est pas acide, il est insoluble dans l'alcool absolu. |
Le pigment est insoluble dans les alcools méthylique et amylique, dans l’éther, l'alcool éther, l’acétone, le chloroforme, le xylol, le benzol, l’éther de pétrole, la vaseline liquide, les huiles et les essences, la glycérine et le sulfure de carbone.
L’eau qui en est le meilleur solvant, donne des solutions de stabilité variable. Les solutions aqueuses, neutres ou alcalines conservées dans des tubes à essai ouverts ou des flacons bouchés pâlissent et se décolorent rapidement. La décoloration débute toujours par le fond du récipient pour gagner graduellement la surface qui au contact de l'air demeure le plus longtemps bleue ou verte. Les solutions décolorées agitées à l'air verdissent ou bleuissent rapidement.
Les solutions vert pré obtenues par action de la potasse sur une solution bleue où bleu violette se décolorent vite. Elles peuvent se recolorer de même en passant par le vert pour arriver au bleu sous l’action d’une agitation à l’air.
Extraction du pigment
CHamor et THIRY ont constaté que les pommes de terre étaient un milieu de choix pour la production du pigment bleu indigo. C’est donc à ce substratum qu'ils se sont adressés pour extraire le pigment.
À cet effet les pommes de terre alcalinisées, ensemencées avec le Bacille polychrome et devenues d’un bleu indigo intense dans toute leur masse étaient coupées en petits morceaux et exposées à l’air en grande surface Le pigment ayant foncé légèrement, ces Savants épuisaient plusieurs fois
cette masse par de l’eau ou de l'alcool dilué. Si on opère sur de gros morceaux de pomme de terre on obtient des solutions de coloration insuffisante et instable. Les tubercules prennent assez rapidement une teinte rouille alors que la solution se décolore.
Purification du pigment Procédé CHAMoT
On traite par l'alcool dilué des cultures sur pommes de terre alcalinisées par la soude et additionnées de phosphate de chaux. On filtre sur bougie Chamberland et rejette les cinquante premiers centimètres cubes, qui sont d’un rouge pourpre. Le liquide recueilli sans changer de couleur est évaporé à 50° C. jusqu’à consistance sirupeuse (on ne doit pas dépasser 60° C. sinon il y a réduction du pigment). La matière colorante bleu foncé est précipitée par l’alcool fort. Le précipité solubilisé dans très peu d'eau distillée est de nouveau précipité par l’alcool fort. En répétant cette opération et desséchant le produit, on obtient une poudre amorphe gris bleu qui se dissout dans l’eau en donnant une magnifique couleur bleu pur.
Les auteurs n’ont pu obtenir la cristallisation de cette substance.
Action des acides et des alcalis
Les filtrats verts plus ou moins dichroïques des cultures sur gélatine peptone déjà liquéfiée, additionnés de quelques gouttes de potasse ou de soude en solution étendue, présentent un dichroïsme accentué. Un léger excès d’alcali détruit toute teinte rouge et fait apparaître un vert plus brillant. L’ammoniaque fait virer la coloration verte au rouge léger.
Les acides minéraux ou organiques font virer le vert au rouge. Le rouge violet obtenu est variable suivant les acides utilisés. Un excès d’acide décolore complètement. Les filtrats violet rouge ou violet bleu, de cultures obtenues sur gélatine peptone glucose, virent au bleu sous l’action des alcalis étendus. L’ammoniaque au contraire accentue la teinte rouge ; les acides font viver le bleu au violet, puis au rouge.
Les filtrats bleu indigo des cultures sur pomme de terre sodée passent à une teinte violette puis bleue avec les alcalis fixes. Lorsque ceux-ci sont en grand excès on a un vert gazon pur.
Sous l’action de l’ammoniaque le bleu vire au violet, rouge violet pourpre. Sous l’action des acides organiques le bleu vire au violet puis au rouge violet. Par les acides minéraux le bleu se change en violet, wrant au rouge
A rTRO
plus ou moins pourpre suivant l’excès d’acide utilisé. Un grand excès d’a-
cide décolore cependant.
Les couleurs primitives de chacun des filtrats se régénèrent par neutrali-
sation de l'acide ou de l’alcali.
Spectre d'absorption
1° Solution bleue. — Les solutions aqueuses bleu clair donnent une bande d'absorption dont l'intensité est à À — 594 pour un pigment très pur.
Dans le rouge on note un assombrissement léger du spectre, ainsi que dans le bleu et le violet. L’addition d’acide aux solutions bleues produit un déplacement de la bande principale d'absorption vers le violet et un acroissement double de l'intensité. L’addition d’ammoniaque en excès produit un léger déplacement de la bande principalé en même temps qu’une grande diminution d'intensité.
2° Solution verte. — Les solutions vertes non dichroïques provenant de jeunes cultures filtrées, dont on n’a pas recueilli les premières portions de filtrat, ne donnent pas ou donnent une absorption très légère dans le voisinage de la raie D. L’addition d’un peu d’acide produit un léger dichroïsme et une faible bande apparaît.
3° Solution violette. — Avec les solutions violettes la bande principale est déplacée vers la droite.
A la suite de ses remarquables recherches THIRY (1900) a émis l’hypothèse suivant laquelle les différentes colorations sont dûes à une seule et même substance. L'organisme ne produit pas dans les différents milieux des pigments différents comme on pourrait le supposer.
IF = VIOLACÉINE
La production du pigment violet a été signalée chez de nombreuses Bactéries. C’est ainsi que l’on peut citer: B. violaceus ZIMMERMANN (ZOPrF), ADAMETZ,.MACÉ, EISENBERG, FRAËNKEL, NIEMAN.
B. janthinum Zopr, B. janthinus ZIMMERMANN LEHMANN et NEUMANN.
B. membranaceus amethystinus KISENBERG.
B. membranaceus amethystinus mobilis GERMANO.
B. violaceus Laurentius.
B. berolinensis indicus CLAESSEN.
B. viscofucatus HARRISSON et BARLOW.
ol
Les descriptions de tous ces germes sont excessivement brèves et ne permettent pas la justification d’un aussi grand nombre d’espèces.
LASSEUR fait remarquer que le caractère de motilité permettrait de grouper toutes ces Bactéries en deux catégories, les unes étant mobiles, les autres immobiles. Il souligne cependant combien ce caractère est sous la dépendance de nombreux facteurs ; en outre si l'existence d’organes moteurs est prouvée par cette possiblité de déplacement, les fouets peuvent exister cependant chez les plastides temporairement ou définitivement immobiles.
Quelques Savants seulement ont signalé la présence de ces organes moteurs et il serait nécessaire de procéder à une revision de ce groupe.
LASSEUR a extrait d’une culture de Bacille violet effectuée sur milieu synthétique, une matière colorante violette.
Extraction
LASSEUR a utilisé la technique suivante: Û
Les voiles obtenus sur milieu nutritif étaient lavés soigneusement à l’eau distillée puis desséchés dans le vide sur l’acide sulfurique après avoir été exprimés légèrement entre des feuilles de papier filtre. Le produit obtenu était pulvérisé et le traitement par l’alcool fort de cette poudre donnait un liquide que l’on additionnait d’un peu d’eau et l’on évaporait ensuite dans le vide à 40°-50° C. pour réduire le volume de la solution à quelques centimètres cubes. On obtenait alors des flocons violets que l’on dissolvait sur filtre avec de l’alcool faible. L’évaporation dans le vide précipitait une matière colorante qui était soumise à une série de purifications par solubilisation dans l’éther, puis dans l'alcool, etc.
À la fin de ces opérations LASSEUR obtenait une poudre noire, mate, sèche, qu'il purifiait par la méthode capillaire avant de la soumettre à l’ana-
lyse spectrale.
Propriétés du pigment violet
La matière colorante, insoluble dans l’éther de pétrole, la benzine et le sulfure de carbone, fournit des solutions de coloration variable suivant le
solvant utilisé.
L’acide chlorhydrique et l’acide azotique ne paraissent pas dissoudre cette substance que l'acide sulfurique concentré solubilise facilement en donnant une liqueur jaune orange.
Les solutions alcooliques de violacéine virent au bleu sous l’action de l'acide chlorhydrique et sulfurique tout en présentant des variations importantes du spectre d'absorption.
La matière colorante donne avec la soude concentrée une solution verte passant rapidement au jaune orangé.
L'ammoniaque, qui se dissocie beaucoup moins que la soude, paraît être sans action sensible. La soude agit beaucoup plus facilement sur les solutions alcooliques de matière colorante.
Les oxydants tels que l’eau oxygénée à 100 volumes, les perborates, etc. qui n’ont pas d’action à la température ordinaire décolorent ces solutions à la température de 50° C.
Spectre d'absorption
Pour caractériser les violacéines, les propriétés chimiques ne suffisent pas ; il est nécessaire d’avoir recours à l’étude du spectre d’absorption.
Les spectres d'absorption des violacéines ont été étudiés par de nombreux auteurs. En particulier LECOQ DE BoISBAUDRAN a caractérisé en 1882 une bande d’absorption dont le milieu apparent avait lieu vers À = 581 pour un pigment violet d’origine bactérienne se produisant dans certaines colles de farine.
J: HARTLEY (1913) a étudié à l’aide de la méthode imaginée par son père, le pigment sécrété par le Bacille violet de l’eau; la solution alcoolique du pigment ne fournissant pas d'absorption sélective dans l’ultra violet, offre une seule bande d'absorption s'étendant de À} = 6.439 à À = 5.000 environ dans le spectre visible, pour une solution alcoolique renfermant 22 Mmgr. pour 10 cm° d'alcool sous une épaisseur de 5 mm. Lorsque la solution alcoolique renferme 22 mmgr. pour 8o cm, sous une épaisseur de 5 mm. la bande d'absorption s'étend de À = 6.439 à À = 6.000.
Les expériences reprises par LASSEUR et GIRARDET sur des solutions alcooliques (à 5 mmgr., 3 % de matière colorante) leur ont permis d'observer une large bande d'absorption asymétrique en même temps qu'une absorption continue du violet. Par dilution de la solution alcoolique con-
centrée, la bande d'absorption se dédouble en deux bandes dont les maxima de FORMANEK-GRANDMOUGIN sont reproduits dans le tableau suivant :
Maximum
Désignation des Bandes de Formanek-Grandmougin 1° bande == 6290 2° bande Ni DAlD
La bande 1 est très faible, nébuleuse. Cette bande est facilement perceptible lorsqu'on opère sur des solutions très diluées dont on fait varier l’épaisseur. |
La bande 2 est assez faible.
L’addition d'acide sulfurique fait varier considérablement le spectre d'absorption de la violacéine qui présente alors trois bandes d’absorption.
Nous reproduisons dans le tableau suivant le maximum de FORMANEK- GRANDMOUGIN pour des solutions alcooliques (concentration 26 mmgr. de substance colorante pour 100 centimètres cubes de solvant) additionnées de 2 centimètres cubes d'acide sulfurique pour 100 centimètres cubes de liquide.
Maximum de Formanek-Grandmougin Observations landes IAE 7OAS . bande forte Pbande er ii (27) bande nébuleuse dDatite- ne =k—— 800 bande très faible
mais persistant longtemps
Pour certaines épaisseurs la deuxième bande n’est nettement visible qu'avec un verre absorbant.
Dans l’ultra violet le spectre d'absorption de la violacéine n’est pas très caractéristique. On note deux bandes d'absorption. L'addition d’acide sulfurique dans des solutions alcooliques ne modifie pas sensiblement le spec- tre d'absorption.
En comparant les spectres d'absorption de la solution verte d’oxychlororaphine réduite et de la solution bleue du pigment violet, il est curieux de constater que les trois premières bandes d'absorption de ces deux pigments auraient lieu pour une même longueur d’onde. Ces résultats ont fait écrire à LAssEUR et GIRARDET (1926): « qu'il était possible que la
solution verte d’oxy-chlororaphine réduite soit un mélange de deux colorants: l’un bleu (B), l'autre jaune (JT) ».
La solution sulfurique bleue du pigment violet renferme en toute évidence un colorant bleu B’. Les colorants B et B’ possèdent certainement des groupements communs. Cette hypothèse paraît d'autant plus vraisemblable que les récents travaux de KôGL et ses Collaborateurs, de WREDE et ses Collaborateurs rapprochent la pyocyanine de la chlororaphine.
