EXAMEN APRÈS COLORATION À L'AIDÉ DE RÉACTIFS

Après avoir défini la morphologie externe de la Bactérie, il est néces- Saire de pénétrer plus avant dans sa structure et ce, grâce à l'emploi de solutions colorantes.

La membrane de la plastide limite une matière de constitution complexe que l'on appelle le cytoplasme. Celui-ci possède des propriétés particulieres et ne peut être considéré comme quelque chose d'homogène au sens des physiciens.

Si le cytoplasme nous apparait le plus souvent comme quelque chose d'homogène, maintes fois cependant il est possible de percevoir des ponts transversaux. C’est alors qu'il est nécessaire d’avoir recours à des procédés spéciaux d'investigation tels que la coloration, pour mettre en évidence une structure et la présence d'éléments spéciaux dans le suc cellulaire.

L'utilisation de solutions colorantes non phéniquées permet de signalet des détails qui passent inaperçus à un examen direct du matériel. Nous

aurons l'occasion de préciser davantage ce point lorsque nous envisagerons la structure de la plastide.

L'examen de germes à l’état vivant mis en suspension dans un liquide auelconque ne peut suffire à toutes les exigences. La transparence de la plastide bactérienne est parfois si grande qu’il est difficile de la distinguer, sa réfringence se confondant presque avec celle du milieu employé. Bien visible dans les milieux aqueux et sur un substratum constitué par une gélose peptone comme l’a observé HILL (1902), l'observation en est plus dificile dans des liquides visqueux plus réfringents. Si au contraire on a recours à des méthodes de coloration, la Bactérie, teinte d’une nuance écla-. tante, sera plus facilement repérée. De plus, grâce à certaines techniques, elle pourra trancher sur un fond coloré d’une autre teinte.

Il est donc possible de fixer sur les Bactéries une matière colorante, mais ceci en prenant certaines précautions.

On doit tout d'abord conserver aux éléments leur structure primitive et pour les soustraire à l’action souvent nuisible des liquides colorants il est nécessaire de les fixer dans leur forme en ayant recours à des techniques particulières.

Cette opération de fixation s'effectue le plus souvent à l’aide de la chaleur ou par l'emploi de liquides spéciaux. Ceci étant fait, on examine si le matériel utilisé se colore facilement par des colorants d’aniline tels que le bleu de méthylène, le bleu de toluidine, le vert malachite, par des colorants rouges tels que la fuchsine.

Parmi les méthodes de coloration qui doivent être utilisées il en est deux qui retiendront plus particulièrement l'attention des chercheurs :

1° Ja méthode de ZIEHL NÉELSEN.

Celle-ci bien connue des Bactériologistes permet de préciser si le germe examiné, coloré avec la fuchsine de ZIEHL voit sa teinte rouge résister à l'action décolorante de l'acide nitrique au 1/3 et de l'alcool à 95° ou de ces deux liquides à la fois. Les Bacilles tuberculeux par exemple colorés par la fuchsine de Z1EHL sont à la fois acido et alcoolo résistants et se séparent de Bacilles voisins constituant le groupe des Para-tuberculeux, possédant seulement la faculté de résister à l’action décolorante de l'acide,

mais pas à celle de l'alcool.

2° Ja méthode de GRAM.

Depuis les travaux de GRIMME (1902), NEIDE (1904), À. MEYER (1912) on sait que de nombreux facteurs peuvent entrer en ligne de compte dans la coloration de Gram pour en modifier l'allure.

Reprenant cette étude avec ses collaborateurs, ScHMiTr (1927), Cou- DRAY (1929), LASSEUR a précisé le rôle capital de la décoloration. Il a de plus déterminé les facteurs qui, en la modifiant, influent sur le résultat de la coloration.

C’est ainsi qu'il a souligné le rôle:

1° des germes utilisés ;

2° de la nature, de l’âge, de la température, de la concentration du colorant, de son temps d’action;

3° de la solution iodo-iodurée ;

4° du décolorant alcool acétone (NICOLLE), alcool absolu, alcool à 96 alcool à 8o° (MEVER et ses élèves) ;

5° de la coloration de contraste.

De ces études, résulte la nécessité de substituer à la notion de « prend ou ne prend pas le Gram » celle de « vitesse de décoloration » (LASSEUR).

Ces quelques restrictions étant faites il est nécessaire d’insister sur l'état de la solution colorante à utiliser. Le pouvoir tinctorial et la stabilité d'une solution colorante varient suivant que l’on additionne l’eau à la solution concentrée ou inversement. Il faut reconnaître d'autre part aue les solutions hydro-alcooliques concentrées ont une durée toujours Hmitée et parfois bien éphémère.

On sait que c'est au stade du «trouble naissant » des Bactériologistes (transition entre la solution et la précipitation complète), que l’on obtiendrait les colorations les plus intenses. Les travaux de ZsiGMoNDy (1901), les recherches de BourTaRIc et de ses élèves (1931), ont souligné des faits qui devaient modifier le mode de préparation des solutions colorantes. Après ZSIGMONDY qui a montré l’action stabilisante de certaines substances visà-vis des solutions colorantes, BouTARIC a signalé que « l'addition d’un électrolyte en quantité très faible protège le colloïde contre la floculation produite par des doses plus fortes du même électrolyte ».

C'est en mettant à profit ces actions stabilisantes et protectrices que LasseuRr, Dupaix et MaAGurror (1931) ont indiqué une technique permettant de préparer des solutions colorantes « standard » de très grande stabilité.

Depuis, de nombreuses recherches ont été effectuées au Laboratoire de Microbiologie de la Faculté de Pharmacie de Nancy par LAssEUR et ses Collaborateurs à l'aide de ces solutions qui donnent des résultats cons-

tants (1). Actuellement il est impossible d’étudier la réaction de GRAM sans avoir recours aux solutions colorantes stabilisées.

Structure de la plastide

L'étude systématique d'une espèce bactérienne doit comporter l’exaînen d’un certain nombre d'éléments entrant dans la constitution de la plastide :

Membrane.

Les Bactéries ou Schizomycètes ont été envisagées par NAEGELI, EHREN- BERG, COHN, SCHRÔTTER du point de vue Botanique et dès les premiers temps de la Bactériologie on a signalé la membrane des Schizomycètes.

D'autre part ZoPr, de Bary, MiIGuLA, P. VUILLEMIN, GUILLIERMOND, PENAU, M et Madame HOLLANDE décrivent la membrane chez de nombreuses Bactéries.

Jusqu'en 1897, l'existence de la membrane ne fut mise en doute par personne et déjà FISCHER (1895) admettait que toutes les Bactéries comprennent une membrane et un protoplasme; mais en 1897 ZETTNOW déclare qu’il lui est impossible de voir une membrane chez les Smirilles et chez B. granulosus. L'auteur rejette la notion de membrane. Dès 1891, ZETTNOW, utilisant les méthodes de coloration de fouets, arrive à considérer deux parties chez les Spirilles: une partie centrale se colorant d’une façon intense, et une partie périphérique très difficilement colorable. La partie périphérique constitue le plasma (protoplasma) et la partie centrale le noyau.

En 1902 BurTscaLr considère la plastide de Spirillum volutans comme formée par un corps central régulièrement coloré et offrant des grains. Ces grains constituent la partie la plus importante de la plastide. Le corps central est entouré d’une bordure étroitement colorée, à structure alvéolaire et, en 1809, ZETTNOW proposait le terme d’ectoplasma pour désigner la partie du plasma qui n’est perceptible qu'après mordançage et coloration de la plastide, le nom d’endoplasma étant réservé à la partie du plasma qui se colore en bleu par la méthode de ROMANOWSKI. GOTSCHLICH (1912) se range aux conclusions de ZETTNOW.

EIsENBERG (1909) fait une subdivision dans l’ectoplasme. Pour lui,

(1) Malgré l'emploi de solutions stabilisées. standard il est nécessaire d'utiliser un germe déterminé comme test de décoloration. LASsEUR emploie d'habitude dans ce but une culture de Staphylococcus aureus.

EE MTOT—

l'ectoplasme de ZETTNOW comprend une membrane et une couche corticale.

IT est curieux de constater que tous les auteurs modernes qui parlent d'ectoplasme paraissent attribuer à ETSEN BERG une théorie qui doit être imputée en réalité à ZETTNOW et qui fut déjà en partie démembrée par Er- SENBERG. Or, en 1918 ZETTNOW revient sur sa conception première, l’auteur admet l'existence de la membrane même chez les Spirilles, mais il déclare ne pouvoir préciser nettement le rapport qui doit exister entre l’ectoplasme tel qu'il l'a défini autrefois et la membrane telle qu’il la conçoit aujourd'hui.

Arthur MEYER (1912) a mis en évidence une membrane chez bien des germes. [l'utilisait des réactifs assez complexes déterminant à la fois, tout au moins pour certains, une plasmolyse et une coloration. Ce savant employait couramment la fuchsine formolée en vue de mettre en évidence la membrane chez les Bactéries.

HOLLANDE et ses élèves, à l’aide d’une solution de bleu de Nil (solution aqueuse à 0,2 %) ont démontré l'existence d’une membrane chez les Bactéries.

A. Dupaix (1933) a été conduite à admettre l'existence d’une couche orientée telle que la conçoit LEcOMTE pu NouY relativement aux hématies. Selon cet auteur bien des faits observés dans la nutrition des Bactéries seraient inexplicables si l’on ne faisait pas intervenir une membrane dans la constitution de la plastide (1).

Capsule.

La question de la capsule chez les Bactéries a été très controversée.

À. MEYER (1912), admettait l'existence de deux parties dans la membrane, l'une très mince, très réfringente, se colorant facilement, correspondrait à la membrane des Bactériologistes : l’autre peu réfringente, se colorant par des méthodes spéciales, disparaîtrait dans certaines conditions, elle constituerait la capsule des Bactériologistes. Du fait de son aspect mucilagineux, À. MEYER serait assez enclin à considérer la capsule comme le résultat du € gonflement des couches extérieures de la membrane ».

Si pour certains auteurs le nombre des Bactéries capsulées paraît être

(1) À. DüpPaix préconise pour l'observation de la membrane chez les Bactéries Pexamen sur fond noir avec un dispositif permettant de réaliser un champ parfaitement noir où la membrane des éléments microbiens se détache sous form: d’une ligne brillante très réfringente, On pourrait de cette manière prcevoir avéc une grande netteté les cloisons transversales des éléments bactériens réunis en filaments.

limité à quelques espèces, pour d’autres au contraire, de très nombreux germes seraient susceptibles de présenter une capsule.

Ces divergences s'expliquent très facilement lorsqu'on sait qu'il est nécessaire d'observer des germes tels que le Pneumocoque ou le Pneumobacille dans des milieux contenant de l’albumine ou des hydrates de carbone, pour mettre la capsule en évidence.

L'importance de la capsule paraît être en rapport avec la nature du milieu nutritif dans lequel croissent les Bactéries.

La capsule a suscité de nombreux travaux, mais aucun ne semble avoir apporté des précisions suffisantes pour donner à cette question une solution définitive dans l’état actuel de la Science.

De nombreuses méthodes peuvent être utilisées pour la mise en évidence de la capsule chez les Bactéries. Les plus courantes sont celles utilisant la réduction des sels d'argent ou l’emploi des solutions colloïdales.

Cytoplasme.

Vacuole. — C'est MicuLA (1894) qui le premier a mis en évidence et a décrit la vacuole chez les Bactéries. Il établit que chez celles-ci la présence de vacuoles centrales est un fait d'ordre très général. Pour A. MEYER (1912), on peut rencontrer fréquemment plusieurs vacuoles dans la même plastide.

GRIMME (1902) aurait montré qu’elles sont particulièrement bien visibles dans les bâtonnets germinatifs, n'étant pas encore cachées par d’autres inclusions à ce stade de leur développement.

LassEUR (1911), étudiant B. chlororaphis, a montré que dans les cultures jeunes, les Bacilles possèdent un cytoplasme homogène et que dans des cultures vieilles on voit se former des vacuoles qui tout d’abord isolées se fusionnent quelquefois et finissent par occuper une grande partie de la cellule. À ce moment le cytoplasme se condense aux pôles affectant des aspects assez différents.

Les vacuoles sont difficilement perceptibles sans coloration et apparaissent facilement lorsque les plastides sont traitées par du bleu de méthylène ou par la solution iodo-iodurée préconisée par À. MEYER.

Par contre chez les plastides fixées par la chaleur ou tout autre procédé les vacuoles démesurément grandies seraient considérées comme étant le résultat d’une altération dûe à la fixation.

Dans l'étude du contenu cytoplasmique il est donc de toute nécessité d'opérer sur le frais ou avec des colorations vitales car on s'expose, en utili-