CHAPITRE I

Méthodes et techniques.

Dans ce premier chapitre, nous exposerons succinctement les diverses techniques auxquelles nous avons dû faire appel au cours de notre travail.

Tout d’abord, nous constaterons avec A. SARTORY [52], que le diagnostic de la blastomycose ne peut se faire que par des recherches de laboratoire.

Prélèvement des crachats.

En raison des microorganismes les plus divers et souvent très pathogènes qui peuvent se rencontrer dans les crachats et des souillures éventuelles provenant de l'air, etc. il est nécessaire d'apporter tous ses soins au prélèvement de ce matériel pathologique. Nous les avons recueilli toujours dans des vases très propres préalablement soumis à la stérilisation à l’autoclave à 120° pendant une 1/2 heure. Nous avons fait usage de flacons à large ouverture bouchés à l’émeri et aussi de larges boîtes de PÉrRI enveloppées dans du papier Joseph. Ces deuxièmes récipients paraissent plus commodes pour recueillir les expectorations et le malade risque moins de souiller l'extérieur du verre.

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Nous avons suivi la technique indiquée par DoprTER et Sac- QuÉPÉE[53]et de cette façon nous avons pu nous débarrasser des microorganismes saprophytes toujours très nombreux qui proviennent du pharynx et de la bouche. Cette méthode a été inspirée par Kirasaro ; voici en quoi elle consiste : recueillir le crachat dans un récipient stérile renfermant du soluté de chlorure de sodium physiologique stérile ; à l’aide d’une pince porter dans un deuxième vase d'eau physiologique stérile ; agiter ; le lavage sera répété une troisième fois ; on prélèvera une parcelle au centre. Ce procédé est très utile quand on désire pratiquer des cultures à partir des prélèvements.

Examen direct.

Les crachats recueillis stérilement, nous pratiquons un certain nombre de prélèvements au moyen du fil de platine stérile et nous les étalons sur des lames de verre nettoyées et stérilisées par flambage. On sèche les préparations ainsi confectionnées en les plaçant à l’étuve à + 370 pendant 1 à 2 heures ; les frottis sont ensuite fixés par la chaleur en les passant d’un mouvement lent et régulier à 3 ou 4 reprises au-dessus de la flamme d’un bec BUNSEN.

Le premier lot servira à l'obtention de colorations simples au moyen des colorants habituels tels que thionine phéniquée, bleu de méthylène, violet de gentiane.

Le deuxième est réservé pour la méthode de Grau que nous pratiquons de la façon suivante :

On colore tout d'abord par le violet de gentiane phéniqué.

Laver rapidement pour enlever l’excès de matière colorante (certains ne lavent pas mais rejettent simplement l'excès de matière colorante).

Mordancer par le liquide de LuGoL (30 secondes à une minute), le frottis prend alors une teinte brun noir.

Laver à l’eau.

Différencier par l'alcool absolu ou par l’alcool-acétone.

Laver à l'eau et colorer le fond en traitant la préparation

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par l'éosine aqueuse ; on laisse en contact pendant une à deux minutes.

Le troisième lot de préparation directe nous a servi pour rechercher la présence éventuelle de microorganismes acido-alcoolo-résistants. À cet effet, nous les avons coloré: par la méthode de ZIEHL NIELSEN :

Les frottis séchés et fixés sont recouverts de fuchsine phéniquée de Z1EHL ; on chauffe ensuite à l’aide d’une petite flamme jusqu'à ce que des vapeurs se forment au-dessus du frottis et même jusqu'à ce que le liquide commence à entrer en ébullition ; on relire du feu, on rejette l’excès de: colorant ; on recouvre le frottis de fuchsine phéniquée et on recommence {rois fois l'opération.

On décolore ensuite par l'acide azotique au tiers ou l’acide sulfurique au quart pendant quelques secondes. On lave à l’eau ; le frottis qui avait pris une teinte jaunâtre passe au rose ; on lave à grande eau ; on décolore par l’alcoo] absolu jusqu’à ce que la surface de la préparation présente une teinte faiblement rosée. On lave à grande eau ; on colore par une solution faible de bleu de méthylène aqueux ; on lave, on sèche et on examine à l'immersion.

Cultures.

Nous n'avons pas à démontrer ici la nécessité des cultures à partir du matériel pathologique ; ce sont elles qui nous permettent d'opérer une diagnose exacte et d'accorder une place rationnelle au parasite dans la classification. D'autre part, c’est par les cultures! qu’on parvient à isoler l’organisme des nombreux saprophytes qui le souillent et à l'obtenir à l'état pur.

On a eu recours à la plupart des milieux utilisés en mycologie parasitaire ; parmi eux nous avons retenu comme éminemment favorables le milieu de SABOURAUD maltosé en ce qui concerne les substrats solides et le bouillon maltosé, pour ce qui est des milieux liquides.

Isolement. — Nos premières cultures à partir des crachats ont été pratiquées sur milieu de SaBouRAUD maltosé

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et sur bouillon maltosé. Après les avoir abandonnées à l'étuve à + 370 dès que les premières colonies eurent apparu sur les milieux solides et dès qu'un trouble se fut manifesté dans les milieux liquides nous recourûmes aux techniques d’isolement. Parmi les nombreuses méthodes nous en avons retenu deux : la méthode des stries en boîte de Perri et la méthode des dilutions en milieu liquide.

La première méthode se décompose comme suit: des tubes de milieu de SaBouRAUD maltosé solide stérilisé sont liquéfiés au bain-marie et on coule le milieu dans des boîtes de PETRI stérilisées en prenant toutes les précautions d'asepsie nécessaires pour éviter les souillures accidentelles. Les boîtes placées horizontalement sur une surface plane sont soumises au refroidissement ; la solidification s’opère. On dilue alors une petite quantité de crachat dans du sérum physiologique stérile ; nous prélevons une petite quantité de cette dilution au moyen de l’ôse de platine et, soulevant avec précaution le couvercle de la boîte de PETRI; nous dessinons à la surface du milieu nutritif une série de stries parallèles sans jamais recharger notre ensemenceur. Les boîtes ainsi ensemencées sont disposées à l’étuve à + 37° et observées chaque jour.

La méthode des dilutions utilise les milieux liquides : prélevant une petite quantité de l’émulsion précédente, nous l'avons introduite stérilement dans un premier tube de bouillon maltosé ; après avoir opéré un mélange aussi homogène que possible par agitation, une goutte de ce milieu prélevé à l’aide d’une pipette de PASTEUR a été introduite dans un deuxième tube de bouillon maltosé stérile. Nous avons répété cette opération une dizaine de fois. Les tubes ainsi ensemencés ont été placés à l’étuve à — 370 et observés quotidiennement.

C'est la première méthode qui nous a donné les meilleurs résultats.

Cultures en cellules.

Sur le conseil de notre Maître, nous avons, à partir de l'organisme obtenu en culture pure, effectué un certain

nombre de cultures sur divers milieux, mais avant tout, pour étudier la morphologie de notre blastomycète et pouvoir suivre sa croissance au jour le jour avec le microscope, nous avons effectué des cultures en goutte pendante.

Délaissant la méthode qui utilise les anneaux de Van TIEGHEM, nous avons fait appel à une technique plus moderne qui emploie les boîtes de BoRREL : ce sont, comme on le sait, de petites fioles cylindriques munies d’un ajutage latéral ; l’une des faces est ouverte ; on l’obture au moyen d'une fine lamelle que l’on fixe avec de la colle forte ; l’ajutage latéral reçoit un tampon de coton ; ces appareils ont été soumis à la stérilisation par voie sèche pendant 1 heure à + 160° ; après cette opération, le lutage de la lamelle est consolidé par un revêtement extérieur de cire à cacheter.

Les appareils sont alors prêts pour opérer les cultures en goutte pendante : voici comment on opère : par l’ajutage latéral et aseptiquement on introduit une goutte de milieu liquide que l’on dépose sur la lamelle ; de plus, une goutte d’eau distillée stérilisée est placée sur le fond de l'appareil de façon à entretenir dans la chambre l'humidité nécessaire.

Toujours par l’ajutage latéral, une petite quantité de la culture est placée au centre de la goutte de milieu nutritif. Ces boîtes sont disposées à l’étuve et journellement on peut suivre au microscope le développement de l'organisme que l’on étudie. Nous décrirons, lors de l'exposé de nos résultats, dans le chapitre qui suit les observations que nous avons pu faire.