TECHNIQUE

Prélèvement : On prélève par ponction veineuse 4 ce 5 de sang qu'on mélange immédiatenwent avec 0,5 ce de solution décalcifiante. Il est préférable de recueillir directement le sang dans un tube à centrifuger, muni d'un trait de jauge à 5 cc et contenant les 0.5 ce de solution décalcifiante. On peut, sans inconvénient, prélever des quantités moindres ou supérieures de sang à conditions de conserver la proportion de 1 p. 9 dans le rapport décalcifiant/sang. Le dosage doit être fait dans les 5 heures qui suivent le prélèvement, le plasma étant conservé en glacière ; nous verrons, en effet, que le taux de prothrombine diminue par conservation, sans qu'il soit possible de prévoir la valeur de cet abaissement.

Matériel :

— Solutions décalcifiantes : oxalate de soude à M/10 (1,34 p. 100), ou citrate de soude à 2,5 p. 100.

— Solulions récalcifiantes : chlorure de calcium à M/40 pour la solution d'oxalate et chlorure de calcium à M/20 pour ja solution de citrate.

— Bain-marie thermostatique réglable entre 38 et 40e.

— Tubes à hémolyse calibrés, très propres.

or gr.

—Deux pipettes terminales graduées en dixièmes de ec. et de 2/10 ce au moins.

— Deux pipettes terminales graduées à 0,5 ce et de2/10 cc au moins (*).

— Un chronographe gradué en cinquièmes ou dixièmes de seconde. !

— Une centrifugeuse {3.000 t/m).

— Solution de thromboplastine

Poudre decerveaurde lapin. :...:....... OBS r. Sérum physiologique à 9 p. 1.000........ 4,9 ce. Sonore entemE) EURE EE RE (Nec:

On porte ce mélange au bain-marie à 40° au moins et 45° au plus et on laisse chauffer 10 à 15 minutes en agitant toutes les minutes. On centrifuge 10 minutes à 3.000 t/m. et on prélève la solution opalescente qui surnage. On devra conserver cette solution en glacière et ne prendre à chaque dosage que la quantité nécessaire, car les variations de température diminuent lactivité de la thromboplastine.

Préparation de la poudre de cerveau de lapin : On prélève les cervelles intactes de lapins récemment tués par injection de 20 cc d'air dans la veine marginale de l'oreille. On enlève les méninges et les vaisseaux sanguins. [1 ne doit rester aucune trace de sang. Au besoin, on lavera avec un peu de sérum physiologique. On broie alors les cervelles dans le double de leur volume d’acétone anhydre. On filtre sur un linge. On fait ainsi plusieurs passages dans l'acétone, foujours en broyant dans un mortier. On rejette à chaque fois l'acétone utilisé et on exprime la pâte de cervelle. On finit par obtenir une poudre fine, presque blanche qu'on filtre une dernière fois et qu'on sèche à létuve ou de préférence dans le vide d’un dessicateur. On peut conserver en tube fermé ou mettre sous azote la poudre dans des ampoules scellées (mettre 0,3 gr. de poudre par ampoule; Il est préférable d'opérer sur 10 cerveaux environ, on réalise ainsi une économie de temps et d'acétone, de plus la valeur thromboplastique de 1a poudre est beaucoup plus constante. La conservation du produit est d'environ 1 mois et demi en glacière dans l'air et de 6 mois sous azote.

Si nous nous sommes ainsi étendu sur la préparation de la thromboplastine, c’est qu'elle joue un rôle capital dans la détermination du taux de prothrombine par la méthode de Quick. Son activité doit permettre de saturer le plasma en faveur activant hexogène éliminant ainsi l’influence de Pactivateur plasmatique d'origine plaquettaire. Quick à déterminé de manière très stricte la quantité de thrombo-

(*) Les pipelles servant au séro-diagnostic de Kline sont utilisables.

(**) On emploiera la même solution que celle qui a servi à dé calcifier le sang.

plastine nécessaire et il serait, à notre avis, très dangereux de diminuer cette concentration ; on s'exposerait ainsi à faire intervenir dans le dosage des corps n'ayant aucun rap”. port avec Ja prothrombine, Tanturi et Banfi (121) emploient uue solution de thromboplastine dix fois moins forte comme concentration que celle préconisée par Quick et obtiennent des temps variant entre 16 et 17 secondes, pour des plasmas humains, mais ils laissent en suspension l'extrait cérébral dans la solution de thromboplastine, substituant ainsi des facteurs de surface, pseudoractivateurs, à l’activateur vrai, nous pensons qu’ils commettent une grave erreur.

Conduite du dosage : Mettre dans le bain-marie à 38° la solution de thromboplastine et la solution de chlorure de calcium. les pipettes respectives plongeant dans chaque tube (pipette au 1/10e ee.) Le sang avant été “entrifugé 5 minutes à 3.000 t/m., prélever le plasma (éviter qu'il y ait une hémolyse au cours des manipula- “tions) et le placer dans le bain-marie avec une des pipettes graduées à 0,05 ec. :

Prendre 0,2 ec. de plasma qu'on met dans un tube à hémolyse.

Ajouter 0,2 cc. de solution de thromboplastine. Mélanger.

Prendre alors le chronographe dans une main et la pipette contenant 0,2 ec. de solution récalcifiante dans l'autre (*).

Souffler rapidement le chrorure de calcium dans le tube à hémolvse en évitant la formation de bulles.

Déclancher en même temps le chronographe.

Agiter dans le bain-marie pour mélanger plasma, thromboplastine et chlorure de calcium. Au bout de 10 secondes environ, on sort le tube du bain-marie et on lui fait subit des rotations rapides de 60 à 80° autour d’un axe horizontal.

Lorsque le liquide ne suit plus les déplacements, on arrête le chronographe (**), Le temps lu correspond au « temps de Quick ».

La coagulation étant explosive, un observateur entrainé peut faire une erreur inférieure à une demi-seconde, I faut, de toute façon, faire deux déterminations pour un même plasma et prendre la moyenne des résultats.

— MÉTHODES GRAPHIQUES POUR LA DÉTERMINATION DU TAUX D'UN PLASMA QUELCONQUE : La détermination du taux d’un plasma quelconque peut se faire de manières très diverses.

(*) On peut aussi bien réduire à 0.1 ce. la quantité de chacun des (rois produits.

(ei Dans cerlaines méthodes, les auteurs préfèrent, pour déterminer le temps de coagulation, se baser sur l'apparition du pre-

ie filament de fbrine (effet Tyndall, prélèvement avec un fi de platine).

ÉRCANEE

Une des méthodes les plus courantes est d'opérer par comparaison avec une courbe étalon.

Etablissement de la courbe étalon : On admet (la démonstralion en a été faite) qu'un sujet en bonne santé a un taux de pro- (hrombine plasmatique égal à 100 p. 100. On prélève donc, suivant la technique habituelle, le sang d'un homme sain (*)}, son plasma sera le plasma témoin servant à l'éfalonnage. Dans ces conditions, le femps de Quick ne dépendra que de l'activité de la thrombhoplastine.

On fait alors une série de dilutions de ce plasma dans un liquide variable que nous définirons par la suite : Liquide de dilution en ec... 0 DOS MO AUTO PONTS 0 85 PTASTT A ANT nee DS EU ee 0:0520:025 0:0125 Concentrations obtenues p.100 100 79 50 25 105025

On obtient les temps de Quick correspondants. On-peut alors, on portant en abcisses les concentrations et en ordonnées les temps

en secondes, dresser la courbe d'étalonnage de la solution de thromboplastine (fig. 2).

C sec

1 # à 15 20 30 «0 50 60 Jo 8o 90 100

Prothrombine %#

Fc. 2: Courbe d'étalonnage. Méthode de Quick

(*) Nous préférons utiliser un plasma masculin moins sujet aux variations. Chez la femme, les périodes menstruelles, la grossesse, les fibromes mêmes peuvent être causes d'erreurs,

Cette courbe étalon est valable aussi longtemps qu’on emploie une même solution -de thromboplastine. En pratique, il est bon de refaire un étalonnage de la solution tous les trois jours et de ne pas garder une solution datant d'une semaine.

On trouve le taux de prothrombine d'un plasma quel conque en interpolant sur la courbe le temps de Qick de ce plasma. Par exemple, un temps de Quick de 18 secondes correspond sur la courbe à un point d'abcisse 41, soit 41 p. 100 le taux cherché.

Tanturi et Banfi préfèrent employer là formule empirique suivante :

P. 100 prothrombine Pour dresser la courbe, on porte alors en abcisses les temps en secondes et en ordonnées les concentrations rela-

tives en prothrombine, soit : © = , on

P. 100 prothrombine obtient une droite (fig. 3).

prothrembine 20. 100 To

to do 30 40 SsoUt

EG. 3 : Courbe d'étalonnage. Méthode de Tanturi et Banfi.

Remarquons que pour un plasma normal non dilué, on à, par définition, p. 100 prothrombine = 100, c’est-à-dire ici : — 16 sec. 6/10 qui représente la condition nécessaire pour que l'équation soit valable.

Cette représentation a, sur la courbe de la fig. 2, un avantage certain; l’interpolation peut se faire facilement pour des valeurs quelconques de t. quand on utilise la droite de la fig. 3, alors que la courbe représentée sur la fig. 2 ne permet une interpolation précise que pour des taux compris entre 10 p. 100 et 50 p. 100, En effet, pour les valeurs extérieures à cet intervalle, une des coordonnées du point de la courbe tend à devenir parallèle à la courbe.

Nous avons vérifié que l'équation classique :

temps normal *X 100

— - = taux de prothrombine p. 100 temps observé

ne s’appliquait pas au calcul du taux de prothrombine, lorsque le temps est déterminé par la méthode de Quick.

— PRÉPARATION DES DILUTIONS DE PROTHROMBINE :

a) Utilisation du sérum physiologique :

Quick, dans sa technique originale, dressait la courbe étalon en diluant le plasma dans du sérum physiologique à 9 p. 1.000. Cette méthode avait le grand inconvénient de diluer en même temps le fibrinogène ; le premier résultat de cette pratique était d'augmenter considérablement la marge d'erreur pour des dilutions supérieures au quart, la coagulation cessant alors d’être explosive par manque de fibrinogène ; le deuxième reproche qu’on pouvait faire à ce genre de dilution était de comparer deux plasmas de compositions totalement différentes : en effet, le plasma témoin contenait non seulement une prothrombine diluée au quart, mais un taux de fibrinogène abaïssé dans les mêmes proportions, alors que le plasma à doser n’était qu'hypoprothrombinémique. On était done conduit à attribuer au plasma hypoprothrombinémique un taux de prothrombine supérieur à son taux normal.

b) Utilisation du plasma déprothrombiné :

Depuis longtemps, on connaissait les propriétés qu'ont certains adsorbants de débarrasser le plasma de la prothrombine, le rendant ainsi incoagulable par recalcification.

re

Il faut toutefois séparer ces adsorbants en deux catégories ; les uns enlèvent le fibrinogène en même temps Ni la prothrombine, ce sont entre autres le phosphate tricalcique (Bordet et Delange — 20), l’hydroxyde de magnésium (Fachs 55 bis), on ne peut évidemment les utiliser ici; les autres laissent à peu près intact le fibrinogène et enlèvent uniquement la prothrombine; ce sont : l’hydroxyde d'alumine, employé par Quick et préconisé récemment par Lavergne (69) et Thodarson (122), le sulfate de baryum utilisé par Dale et Walpole (31) et que Tanturi et Banfi (121) viennent d'étudier à nouveau. Nous avons employé lun et l’autre de ces adsorbants, appliquant pour l'alumine la technique donnée par Lavergne et pour le sulfate de baryum la méthode de fabrication et d'utilisation indiquée par Tanturi et Banfi. Nous trouvons que le sulfate de baryum présente beaucoup d'avantages, en particulier, après un à deux passages le plasma est complètement incoagulable et, de plus, la densité de l’adsorbant étant très grande, on peut l'enlever par centrifugation beaucoup plus facilement que l’alumine; nous avons, par la suite, utilisé pour tous nos dosages une suspension de SO4Ba à 30 p. 100

— Préparation de la solution à 30 p. 100 de SO4Ba

On dissout 35 gr. de BaCI2 cristallisé dans 500 ce. d'eau, on ajoute une solution de 11 ce. de SO4H2 (1.84 d.) dans 500 cc. d'eau. On laisse déposer dans un verre conique ou dans un Erlenmeyer. On décante et on lave jusqu'à ce que la réaction de l'eau de lavage soit neutre au rouge de méthyle. On met alors en suspension dans 100 ce. d'eau distillée et on conserve dans un flacon bouché à l'émeri. On vérifiera de temps à autre la neutralité au rouge de méthyle et on lavera de nouveau si besoin est.

— Adsorption :

Pour adsorber, on mélange 1 ec. de plasma avec 0,2 ce. de la suspension de SO4Ba (*) et on laisse 15 minutes au bain-marie à 37° en agitant. On centrifuge et on décante le plasma surnageant. -On cherche le temps de Quick de ce plasma : en pratique courante, On pourra l'utiliser s'il coagule en plus de 10 minutes. On sera parfois obligé de procéder à une seconde adsorption (après avoir vérifié le pH de la suspension de SO4Ba). C'est le plasma ainsi traité qui servira à faire des dilutions. s

— Avantages et inconvénients de cette méthode :

Cette technique pallie à la diminution du fibrinogène

(9) On peut opérer sur des quantités plus élevées de plasma, mails on devra respecter ces proportions,