PAPE

ble quantité de glucose est insuffisante à assurer pour longtemps sa nutrition ; aussi sporule-t-elle abondamment au bout de deux ou trois jours. Nous avons nous-mêmes utilisé ce milieu pour isoler plusieurs levures d’origine pathologique et les résultats que nous avons pu obtenir nous engagent à le recommander tout particulièrement.

Beaucoup d’autres procédés, fondés sur le même principe permettent d'obtenir des ascospores. Certains consistent à placer de la levure rajeunie dans une mince couche d’eau distillée, sur papier buvard imbibé d’eau ou sur gélatine pure. C’est la méthode de WAssErRzuG. Nous'n’avons pas toujours obtenu de bons résultats avec ce procédé. On peut réaliser la production des ascospores dans l’eau de levure, milieu qui, sans autres substances, est insuffisant pour assurer l'alimentation du champignon ; celui-ci se trouve réduit au bout de très peu de temps à sporuler. Tous les liquides nutritifs disposés en couches extrêmement minces sont également susceptibles de provoquer la sporulation, les matières nutritives étant très vite absorbées et la levure rapidement privée d’aliments.

Les levures sont susceptibles de sporuler souvent aussi sur les milieux usuels solides (gélatine et gélose nutritives, pain humide). Un excellent milieu est la carotte ; ce procédé a surtout été utilisé autrefois par le botaniste REESS. La plupart des levures y forment facilement leurs ascospores, au bout de 6 à 8 jours. Elles y poussent très activement pendant les preniers jours, puis, au bout de quelque temps, le bourgeonnement se modère, probablement empêché par laccumulation de produits toxiques dans la culture, et la sporulation cominence. Ce procédé a été très recommandé par GUILLIERMOND pour les études cytologiques. Il permet de suivre tout le développement d’une levure depuis la germination des ascospores jusqu’à la formation des nouvelles ascospores.

Il facilite en outre les fixations que l’on "peut faire en découpant un petit fragment de la surface de la carotte où la levure s’est développée et en le plaçant dans le bain fixateur. On évite ainsi l’usage des fixations sur frottis qui déterminent toujours une contraction des cellules. Nous la recommandons nous aussi pour les recherches cytologiques sur la copulation et la sporulation des levures. Il faut cependant faire remarquer que cette méthode a l’inconvénient d’exiger beaucoup de temps pour obtenir la sporulation et de ne pas réussir avec toutes les levures,

Certaines espèces sporulent facilement dans les milieux spéciaux. D’autres levures forment très facilement des ascospores dans la plupart des milieux liquides, lorsque l'aliment vient à s’épuiser. À cette catégorie appartiennent les espèces des genres WILLIA et PICHIA qui sporulent ordinairement dans les voiles produits à la surface des liquides.

Tels sont les principaux milieux employés par nous pour obtenir asques et ascospores. Mais disons que le procédé du bloc de plâtre nous a le mieux réussi et nous considérons que c’est la méthode la plus commode pour obtenir les formations sporulées.

Culture en goutte pendante.

Cette technique a été très bien adaptée aux levures par HAN- SEN, au point de devenir une méthode exacte. HANSEN a substitué à l’usage des plaques de verre celui des chambres humides ordinaires ou des chambres de BÔTTCHER, qui permettent de suivre au microscope le développement des colonies.

La chambre humide ordinaire consiste en un porte objet au milieu duquel se trouve une légère excavation que l’on recouvre d’une lamelle. On place à la face inférieure de la lamelle une petite goutte de liquide nutritif (milieux liquides ou bien gélose ou gélatine nutritives chauffée à 30°) qui renferme quelques cellules obtenues par dilution. Le couvre objet est scellé au porte objet par de la vaseline, La chambre de BÔTTCHER, ou chambre de VAN THIEGHEM et LEMONNIER, est composée d’un anneau de verre collé par du baume de Canada sur un porte chjet. A l’intérieur de la petite cellule formée par cet anneau, on place une goutte d’eau, pour maintenir l’air humide, puis on recouvre la cellule d’un couvre-objet sur lequel se trouve déposée une goutte de liquide nutritif contenant une seule ou un très petit nombre de cellules de levure. La lamelle est maintenue adhérente sur l’anneau avec de la vaseline.

Il est nécessaire, de stériliser préalablement ces chambres humides en les passant rapidement à la flamme et de s’en servir avec les précautions nécessaires pour les préserver de la contamination des germes extérieurs.

Nous recommandons tout particulièrement ces appareils, car ils rendent de très grands services. Ils permettent en effet d’examiner au microscope le développement d’une seule cellule pendant plusieurs jours (8 jours ou plus).

Le procédé d'isolement de HANSEN consiste à placer une goutte de gélatine nutritive chauffée à 30° et contenant en dilution les levures à isoler sur un couvre-objet sur lequel se trouve gravé un quadrillage avec 16 carrés numérotés. Le couvre-objet est déposé sur une chambre ordinaire ou de BÔTT- CHER. Une fois la gélatine solidifiée par refroidissement, on compte au microscope le nombre des cellules de levures contenues dans la goutte de gélatine. Cette opération est facilitée par le quadrillage de la lamelle, qui en outre permet de repérer chaque cellule. On note le n° des carrés occupés par les cellules, puis on porte la chambre humide dans une étuve à 25°. Par des examens microscopiques à des intervalles réguliers, il est facile de suivre la multiplication des cellules jusqu'à ce qu’elles aient formé des colonies. Lorsque les colonies commencent à apparaître, on en ensemence un ballon de culture et on obtient ainsi des cultures rigoureusement pures, provenant du développement d’une cellule unique. Nous recommandons tout spécialement ce procédé àssez rigoureux qui permet d'identifier et d'étudier une levure isolée, surtout si elle est nouvelle,

Méthode de LINDNER [91].

LINDNER a préconisé plusieurs méthodes fondées sur le même principe, mais beaucoup plus simples.

L’une d’elles, dite méthode des cultures en goutte (Tr je kullur), consiste à diluer de la levure dans une solution nutritive, de moût de bière par exemple, jusqu’à ce qu’une goutte de la solution ne renferme qu’une seule cellule. On prélève alors, à l’aide d’une pipette à pointe très fine, une certaine quantité de cette dilution qu’on dépose en gouttes serrées sur le fond d’une boîte de PETRI préalablement stérilisée à l’autoclave. Partout où il y aura une seule cellule, il se développera une seule colonie. Le numérotage des colonies et leur examen microscopique permet le repérage des colonies ; à l’aide d’un fil de platine, on les prélève et on les ensemence dans les milieux liquides, en vue d’en obtenir en plus grande quantité. Le procédé n’est cependant pas aussi fidèle que ceux de HAN- SEN, mais il a le privilège d’être plus simple, moins long et il peut néanmoins rendre de grands services.

Une autre méthode, dûe également à LiNDNER, est connue sous le nom de culture en gouttelette (Trôpfchenkultur). Elle

consiste à disposer sur un couvre-objet, avec une plume à dessin où avec un clou à pointe très fine, une dilution de levures dans un liquide nutritif, en petites goutelettes ou en stries plus ou moins serrées.

On place ensuite la lamelle sur une chambre ordinaire ou de BÔTTCHER. Toutes les gouttelettes qui ne renfermeront qu'une cellule produisent une colonie pure, dont on peut suivre le développement au microscope.