CHAPITRE Ier

Etude morphologique et biologique du Cryptococcus corallinus

Ses caractères culturaux et biochimiques

19, Origine:

Cette levure a été isolée pour la première fois dans le laboratoire du professeur A. SARTORY (74) à partir de matériel pathologique provenant du service du docteur HUur- SCHMITT, médecin de l’hôpital du Hasenrain à Mulhouse. Le malade présentait des lésions rappelant la disposition et la structure des kérions trichophytiques.

Des prélèvements de cheveux furent effectués: au laboratoire on les débita en petites portions dont les unes furent ensemencées sur des milieux acides, les autres sur des substrats alcalins.

Parmi les nombreux milieux ensemencés et disposés à des températures différentes, ce n’est que sur gélose de SABOURAUD glucosée et à + 37° que nous avons pu obtenir des cultures de cette espèce en partant des poils parasités.

Nous exposerons par la suite nos recherches relatives à l’action pathogène expérimentale de cet organisme sur les différents animaux utilisés au laboratoire.

20 Examen microscopique de cultures en goutte pendante :

Afin d’être fixé aussi bien que possible sur la morphologie de la levure étudiée, nous avons effectué des cultures en chambre de VAN TIEGHEM : celle-ci est composée d’un anneau de verre collé par du baume de Canada sur une lame de verre (porte-objet). À l’intérieur de la petite cellule, on place une goutte d’eau pour maintenir l’atmosphère de la

chambre suffisamment humide; puis on recouvre celle-ci au moyen d’une lamelle couvre-objet sur laquelle on a déposé au préalable une goutte de milieu nutritif ensemencé au moyen d’une petite quantité de la levure à étudier. On maintient la lamelle adhérente sur l’anneau de verre au moyen d’un lutage à la vaseline. Le milieu de culture que nous avons adopté a été le moût de bière; dans ces conditions, à la température de + 180, nous avons pu constater après 48 heures un début de croissance; l’examen microscopique nous a montré des cellules levures rondes, dans certains cas ovoiïdes, bourgeonnantes de 2 y à 2 b 20 zur 3 y à 3 p 50. Les cellules ne bourgeonnent généralement qu’à une seule de leurs extrémités, donnant naissance à des éléments qui s’individualisent. Jamais dans ces cultures nous n’avons pu mettre en évidence des formes ascosporées.

30 Colorations :

Afin d'établir avec certitude les données que nous avions constatées dans les cultures en cellule et dans les préparations à l’état frais, nous avons eu recours à des méthodes spéciales : nous citerons tout d’abord la méthode au rouge neutre préconisée par GUILLIERMOND. Cette coloration s’opère sur les cellules vivantes : c’est donc une coloration vitale; en effet à une certaine concentration le 7ouge neutre peut colorer les cellules-levures sans les altérer. Pour cela, nous avons disposé une petite quantité d’une culture de notre levure dañs une goutte de solution aqueuse de rouge neutre à I pour 10.000. Dans ces conditions, le protoplasme et le noyau restent incolores et seules les parties en voie de dégénérescence, c’est-à-dire les moins vivantes fixent le colorant : c’est le cas des vacuoles et des corpuscules métachromatiques : dans ces conditions les préparations effectuées nous ont montré une membrane à double contour et un protoplasme tous deux non colorés: dans certains individus: présence d’une vacuole assez importante; ainsi que de corpuscules métachromatiques; les cellules jeunes ne contiennent pas de vacuole.

Des préparations ont été traitées au moyen de sudan III (coloration vitale); ici encore la membrane et le proto-

plasme ne nous ont pas paru colorés; le protoplasme renferme en son intérieur quelques globules de graisses en nombre variable selon les cellules.

Afin de rechercher la présence des spores, on a eu recours aux méthodes spécifiques indiquées à cet effet par SASAKAWA (75) d’une part et par SCHUMACHER (76), de l’autre : nous donnerons ci-dessous ces deux techniques.

La méthode employée par SASAKAWA consiste dans l'emploi de la méthode de HEIDENHAIN à l’hématoxyline au fer (la technique est d’ailleurs indiquée dans le traité de GUILLIERMOND) à propos de l’examen cytologique des noyaux. Le même auteur emploie pour la mise en évidence des spores la méthode de MOELLER : la préparation fixée est immergée pendant 10 secondes à 5 minutes dans de l’acide sulfurique à 1 %. On lave à l’eau, on colore avec de la fuchsine phéniquée en chauffant pendant 1 minute. On différencie par l’acide sulfurique à 5 % pendant cinq secondes; on lave, on contrecolore au moyen de bleu de méthylène aqueux pendant environ 3 minutes; à ce moment on lave, on sèche et on peut examiner.

Afin d'éviter des confusions possibles, nous avons pris la précaution de traiter les préparations fixées pendant deux minutes encore par le chloroforme, pour éliminer au maximum es gouttes de graisse.

Nous avons fait usage également de la méthode de SCHUMACHER recommandée par BUSCHKE et HARRY (77) dans leur magistrale étude sur les levures. Elle consiste à fixer tout d’abord les préparations par la chaleur; on colore ensuite pendant une minute avec une solution phéniquée à 1 %, de bleu de méthylène; on lave à l’eau distillée et on colore pendant une minute et demie en agitant constamment au moyen d’une solution à 1 % de phosphine (di-amidophényl-acridine); les éléments acido-résistants que SCHU- MACHER, BUSCHKE et HARRY prennent pour de la voluiine sont teintés par cette méthode en vert; la nucléine se colore en jaune et les spores prennent une teinte bleue. Nous avons ainsi par ces différentes méthodes obtenu des résultats absolument concordants : jamais dans nos différentes préparations nous n’avons mis en évidence des formations

d’asques où d’ascospores. Nous reviendrons sur ce point par la suite lorsque nous exposerons les différentes tentatives opérées en vue de faire produire à notre organisme sur des milieux spéciaux des formations sexuées.

49 Caractères cullturaux :

Des ensemencements ont été pratiqués à partir des cultures initiales provenant des lésions, sur divers milieux solides : milieu de SABOURAUD, maltosé et glucosé, pomme de terre, carotte, jus de pomme de terre gélatiné, gélatine, albumine d’œuf, banane, pomme de terre glycérinée. (Fig. 5)

Les milieux liquides ont été les suivants : bouillon de viande, bouillon glycériné, liquide de RAULIN neutre, acide, glucosé, eau de malt, moût de bière. Les cultures ont été placées à des températures comprises entre + 259 et + 280 qui réalisent pour l’espèce considérée, comme nous le verrons plus loin, l’optimum cultural. Toutefois nous donnerons ici les caractères culturaux de notreC7yptococcus,lors des premiers ensemencements sur milieu de SABOURAUD à partir des poils.

Culture sur milieu de Sabouraud : Sur ce substrat, à la température de + 370, dans les premières quarante-huit heures, nous ne voyons apparaître aucune végétation; ce n’est que le troisième jour que l’on perçoit une première phase évolutive de la culture; il se produit en effet à cette période autour des fragments de poils disposés sur le milieu de culture solide des formations de couleur blanche, revêtant l’aspect de sorte de gaines à contours nettement limités, la teinte est d’un blanc crème, la levure ne tarde pas à prendre un aspect lisse et visqueux caractéristique de beaucoup de levures.

Par la suite la culture continue a évoluer dans un sens favorable et nous pouvons constater au bout de quatre ou cinq jours la formation d’un tapis humide, glaireux, qui se développe peu à peu en envahissant tout le substrat contenu dans le tube de culture; au point de vue coloration nous ne constatons pas de modification sensible par la suite; la teinte blanc-crème est persistante sur ce milieu et à la température de + 37°. Toutefois, le voile formé ne tarde pas à perdre son aspect lisse et uni; il se plisse bientôt, se déssèche et prend

une forme ridée et vallonnée. Ces cultures abandonnées à + 37° conservent invariablement tous les caractères que aous venons d’énumérer, mais si on les soustrait à la température de + 37° et qu’on vient à les placer à -+ 270, même après huit à dix jours de séjour à la première température, la teinte blanc-crème ne persiste pas; elle se modifie assez rapidement, vire au rose très tôt et nous avons même pu constater dans certaines cultures abandonnées une trentaine de jours à + 27° que cette couleur peut foncer jusqu’à devenir saumon.

Si on dispose immédiatement à + 270 les tubes de culture qui viennent d’être ensemencés au moyen de levures cultivées à + 370, on constate que le deuxième jour le champignon se développe d’une façon très satisfaisante en donnant sur le substrat de petites colonies roses, punctiformes: la coloration s’accentue de plus en plus pour arriver au rouge saumon ou rouge corail. Les colonies qui se sont formées au niveau des régions d’ensemencement se développent suivant une direction centrifuge; au commencement elles offrent peu de tendance à confluer : elles prennent un aspect bien lisse, visqueux, rose; deux ou trois jours plus tard il se forme un tapis bien homogène par suite de la réunion des différentes colonies; ce tapis ne tarde pas à recouvrir entièrement tout le substrat. À partir du cinquième jour la culture se plisse, figurant assez bien en certains points des sortes d’anses intestinales; cet aspect est tout à fait caractéristique. (Fig. 3) Pris d’un doute, nous avons effectué de nombreuses vérifications pour nous rassurer sur la pureté de notre culture; celle-ci nous a été démontrée par nos examens microscopiques. Le septième jour la teinte continue à se foncer; à partir du neuvième jour l’aspect et la coloration ne changent plus, le plissement s'arrête. La teinte est toujours saumonée mais la croissance de notre microorganisme semble cesser à cette période. L’examen microscopique nous montre des cellules levures ovoïdes où rondes bourgeonnant dans certains cas; ces éléments présentent les dimensions suivantes : 1 & 50 à 2 & 50 pour les éléments sphériques; pour les formes ovoïdes:1H25à1#5osur2#50à 34H. (Fig.1)

Milieu de pomme de terre: À la température de + 37° la levure végète assez bien dans les premières heures; la

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culture est d’une teinte blanche, tendant légèrement vers le blanc crème: les troisième et quatrième jours, l’organisme se développe sur la pomme de terre où elle forme un enduit lisse, visqueux, dont la coloration passe au jaune sale. Cette teinte s’accentue par la suite. La poussée se manifeste avec le plus d'intensité vers le fond du tube, dans les régions les mieux favorisées par l’humidité; dans la partie supérieure du milieu végétal où nous avions disposé intentionnellement une petite quantité de levure, nous constatons que cette dernière a végété très faiblement, ne s’est pas étalée; elle a donné un léger revêtement à aspect plâtreux blanc, puis légèrement rosé. L’examen microscopique des prélèvements que nous avons effectués à ce niveau nous a montré des cellules bourgeonnantes, rondes la plupart du temps, différentes de celles qui vivent en profondeur en ce sens : que leur volume a changé; elles sont hyperthrophiées, d’une grandeur atteignant environ le double des élements cellulaires végétant dans de bonnes conditions. Leur diamètre va jusqu’à 54; elles présentent une double membrane particulièrement nette; le protoplasme n’est pas normal; il semble avoir subi une forte concentration; quelques préparations de ces cellules ont été effectuées et colorées au moyen du bleu lactique; par cette méthode le protoplasme se colore bien, les cellules levures sont souvent solitaires; cependant dans quelques cas elles sont associées par trois, quatre ou cinq. Elles sont ordinairement sphériques, rarement ovalaires ou piriformes. Cet aspect a été rencontré par nous dans tous les milieux peu favorables à notre levure, lorsqu'elle souffre. Après dix jours de culture sur pomme de terre, l’enduit formé sur le milieu est toujours jaune sale. Des divers examens que nous avons pu effectuer, nous concluons que ce milieu n’est pas favorable pour l’organisme en expérience, ceci tout au moins à la température de + 370.

Les cultures effectuées sur le même milieu et disposées à l’étuve à la température de + 27 © ont donné dès les premiers jours un développement plus satisfaisant ; la coloration de début est jaune sale, puis jaune foncée tirant sur le jaune vert. A l'examen microscopique, nous rencontrons une prédominance marquée des cellules ovales sur les formes rondes très peu nombreuses. Ici donc, la pomme de terre constitue un milieu

assez favorable à la croissance du Cryptococcus à condition de disposer les cultures à la température de + 270.

En ce qui concerne les autres milieux solides, nous avons pu faire les constatations suivantes : la gélose est un bon milieu; la carotte doit être retenue comme très favorable; la gélatine et l’albumine d’œuf ne sont pas favorables, en effet sur ces deux milieux la croissance est lente et n’aboutit qu’à la formation de petites colonies punctiformes ne se réunissant jamais pour former un tapis homogène.

Sur banane, pomme de terre glycérinée, la poussée est satisfaisante.

Nos ensemencements pratiqués sur les milieux liquides nous ont donné les résultats suivants :

Le liquide de RAULIN, à la température de + 27° constitue un excellent milieu; en effet, après 24 heures d’ensemencement, on constate l’apparition d’un trouble et le début d’un léger voile qui se forme en surface; un dépôt commence à se former au fond du tube; trois jours après ce dépôt est coloré nettement en rouge. En ce qui concerne les cultures sur ce milieu à différentes températures, on peut tirer les conclusions suivantes : à + 189 le voile se forme en surface, mais il est très léger et très frèle, se laissant facilement déchirer; à + 220 il est plus important et résiste plus facilement ; à + 270 il a atteint son maximum de développement, il est coloré en rose et à l’examen microscopique nous remarquons dans nos préparations qu’il est constitué par des cellules rondes, fortement adhérentes les unes aux autres; à + 329 il est beaucoup moins fourni qu’à la température précédente; à + 370 il est très faible; à + 39° nous n’avons pas pu obtenir la production d’un voile dans nos cultures.

Dans le bouillon à + 270 il se forme au bout de quatre jours un très léger voile qui ne reste pas longtemps en surface; à la moindre secousse imprimée au tube le voile tombe et arrive à constituer un dépôt rosé.

Le meilleur milieu liquide est sans aucun doute le moût de bière : en effet, à + 279 , 24 heures après l’ensemencement, la formation du voile est faite et celui-ci est épais et assez résistant ; en même temps il se forme en profondeur un dépôt abondant: on le voit, sur ce milieu la culture est luxuriante.