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Afin d'établir les propriétés biochimiques du champignon 2n étude, on a eu recours à des cultures effectuées sur des milieux minéraux renfermant comme source d’azote un sel ammoniacal minéral. La température de + 270 a été adoptée.

Les mêmes expériences ont été pratiquées sur des milieux renfermant des alcools polyatomiques ou des sucres.

En ce qui concerne la recherche de l’utilisation de l’azote par notre champignon, les milieux de cultures employés ont été les suivants :

19 Miliéd mitraté OPA : 7 EN MERE 1000 gr.

D'ACCHATOSEN, PRPOI EE M FABT Nitrate de potasse ... 2 gr.

Phosphate bipotassique I gr.

Sulfate de magnésie .. I gr.

, Chlorure de sodium .. 0,5 £T.

Phosphate de chaux .. 0,5 gr.

La poussée de la levure sur ce milieu se fait lentement; le voile à peine formé se déchire et microscopiquement nous trouvons peu d’éléments bourgeonnants et une grande quantité de cellules de souffrance.

20 Milieu ammoniacal: Le milieu ammoniacal a la même formule que le précédent avec cette variante toutefois que le nitrate de potasse a été remplacé par du sulfate d’ammonium à la dose de I gr.

Le voile se forme beaucoup plus rapidement (deux fois plus vite) sur ce milieu; il est résistant; en même temps 11 se produit dans la profondeur du milieu un dépôt assez abondant. L'examen microscopique nous permet de constater l’absence de cellules de souffrance; tous les éléments cellulaires présentent l’aspect normal et les formes bourgeonnantes sont en majorité. Par conséquent, le milieu ammoniacal est de beaucoup plus favorable à notre organisme que le milieu

nitraté.

Action sur les sucres : Pour mettre en évidence les caractères de la levure en étude vis-à-vis des différents sucres, nous nous sommes adressé comme milieu de base au liquide de RAULIN dépourvu d’hydrates de carbone. Nous avons ajouté à cette solution, pour chaque cas particulier, le sucre à expérimenter.

On a employé le glucose, lévulose, galactose, mannose, saccharose, maltose et lactose. On a procédé à des ensemencements sur ces différents milieux.Les cultures ont été placées à + 270. Pour contrôler l’assimilation des sucres par notre organisme, nous avons eu recours à la méthode de BERTRAND que nous ne décrirons pas ici étant donné qu’elle est classique.

En outre nous nous sommes adressé à la méthode indiquée par BESson dite du tube B (BESSON, RANQUE et SENEZ) et d’un emploi très pratique.

Ce procédé est basé sur l’action réductrice du microorganisme sur le rouge neutre et les variations notables de cette propriété suivant la constitution du milieu de culture. Les sucres ajoutés en petites quantités à un milieu favorisent la réduction; si on augmente progressivement cette quantité de sucre, l’action favorisante disparaît tout d’abord, puis fait place à une action contraire. i

L'expérience a été faite avec le milieu de culture que nous donnons ci-dessous :

Bouillon, de,viande.de bœuf sante. 1000 cc.

Glacase ere CR RE 8 gr.

Solution aqueuse de rouge neutre à 1 % ACC.

Nous avons réparti ce milieu dans des tubes à essai larges; nous y avons introduit un tube à hémolyse renversé qui sert de cloche à fermentation. Après stérilisation le tube à hémolyse se trouve enfoncé dans le grand tube de culture et le milieu le baigne complètement. On a ensemencé et placé les cultures pendant 48 heures à l’étuve à la température de +220. Cette méthode permet d’apprécier :

a) les phénomènes de réduction du rouge neutre;

b) les phénomènes d’alcalinisation et d’acidification du milieu ;

c) la production ou la non-production de gaz avec le glucose et l’approximation de la quantité de gaz formés.

Les germes qui, sans réduire, acidifient, font virer la coloration vers la teinte amarante; l’alcalinisation produit au contraire une coloration rose saumon ou porto.

La réduction se traduit par une fluorescence.

Cette technique permet donc de classer le champignon étudié dans le groupe des réducteurs, dans celui des nonréducteurs, dans le groupe des germes inertes vis-à-vis des sucres ou des germes attaquant les sucres avec production ou absence de gaz.

Dans ces conditions, nous avons constaté que notre levure réduwsait le rouge neutre (fluorescence apparaissant au bout de 4 à 6 jours de culture). Au début de la culture, il se produit une acidification du milieu, qui fait virer celui-c: vers la teinte amarante. L/assimilation du glucose se produit donc par l'apparition d’une acidification sans production de gaz; en effet le tube à hémolyse reste au fond du tube et le liquide nutritif remplit complètement le volume même après quatre semaines de culture.

La recherche de l’acide lactique ayant pu apparaître au cours de la dégradation des hydrates de carbone, a été effectuée après avoir débarrassé le milieu des acides volatils; nous avons concentré et filtré le substrat pour obtenir une solution limpide et non colorée. Deux parties du réactif d'UFFELMANN au perchlorure de fer ont été ajoutées à une partie de ce filtrat. La présence de l’acide lactique a pu être mise en évidence par le virage de la teinte bleue violette du réactif vers le rouge violacé qui passait ensuite au jaune vert.

D'autre part nous avons agité une partie de notre milieu filtré avec de l’éther : après épuisement l’éther a été décanté et mis en présence d’acide sulfurique et d’une solution alcoolique à 5 % de codéine. Nous avons obtenu un virage vers le brun qui est caractéristique aussi de la présence de l’acide lactique.

Nous pouvons donc conclure que l’assimilation du glucose par notre organisme passe par un stade de dégradation caractérisé par la présence d’acide lactique. Aucune fermentation gazeuse, ni apparition d’alcool n’a pu être décelée.

Pour les autres hydrates de carbone nous avons utilisé la même technique et afin de contrôler l’assimilation de ces matières ternaires par notre levure, nous avons eu recours à des dosages quantitatifs par la méthode de BERTRAND effectués sur ces substances introduites dans les milieux et ceci avant l’ensemencement et après 15 jours de culture.

Dans le tableau suivant, nous exprimons les résultats obtenus au cours de ces recherches; nous notons l’assimilation par la disparition des différents sucres symbolisée par le signe + et l'importance quantitative du phénomène est exprimée par des chiffres représentant le pourcentage.

Saccha-

rose

ASS 107 A IMASS MOI EASS 07 PASS PRESS EC RAS RC AS CA SSSR ENS SACS 30 | 0601 IFR 10 | 1,/8 mni207212 2,70 Pro 0s RE

De ce tableau nous pouvons déduire que notre organisme est incapable d’assimiler le lévulose. Le lactose constitue pour lui un milieu très médiocre ainsi que le mannose. Les glucose, galactose, saccharose, maltose sont de bons aliments ainsi que l’amidon. Sur tous ces sucres le champignon présente une fonction pigmentaire très prononcée et sensiblement équivalente.

Action sur les matières azotées : Recherches sur les propriétés protéolytiques :

Afin de rechercher les propriétés protéolytiques de notre organisme, nous avons ensemencé la levure:

1° Sur des tubes renfermant du séyum coagulé; la culture a été disposée à + 270; le Cryptococcus évolue assez lentement ; il donne une faible culture; après un mois aucun phénomène de liquéfaction n’a pu être constaté.

29 dans des tubes contenant du bowllon de bœuf, nous avons introduit des petits cubes de blanc d’œuf coagulé par la chaleur et stérilisé à l’autoclave. Le milieu a été ensemencé et placé à des températures de + 220 et de + 27e, Ici encore nous constatons la formation d’un voile assez

faible et peu résistant. Jamais nous n’avons pu mettre en évidence le phénomène de liquéfaction, ni même aucune attaque de l’albumine d'œuf.

3° Action sur la gélatine: Notre organisme liquéfie totalement les milieux de gélatine à la température de + 180; au bout d’une période de 14 jours cette liquéfaction est complète.

4° Nous avons d’autre part examiné l’action de notre levure sur le lait tournesolé, par cultures à la température de + 180 et à celle de + 270. À + 270 Ja coagulation du lait est complète le troisième jour et le coagulum n’est pas dissous; par conséquent la peptonisation de la caséine n’a pas lieu.

Cultures sur wilieux spéciaux pour favoriser la production des ascospores : Pour étudier la possibilité de sporulation de notre organisme, nous avons fait appel à deux méthodes :

La première est appelé culture sur blocs de plâtre: Après avoir repiqué notre organisme à trois reprises difiérentes sur du moût de bière, qui, nous l’avons vu, constitue un milieu excellent et rajeunit ainsi notre espèce. Nous avons soumis le champignon à une nutrition très défavorable : nous avons employé le procédé indiqué par ENGEL (78) et perfectionné par HANSEN (79). Nous avons ensemencé notre organisme vigoureux et rajeuni sur un bloc de plâtre obtenu en gâchant du plâtre avec de l’eau et en lui donnant une forme cylindrique au moyen d’un moule. Le bloc a été placé dans un cristallisoir, dans lequel nous avons introduit une certaine quantité d’eau distillée assez grande pour atteindre environ la moitié de la hauteur de notre bloc. Nous recouvrons le cristallisoir à l’aide d’un couvercle; puis nous avons stérilisé tout l’appareil à lPautoclave à 1150 pendant 30 minutes. Nous avons ensuite ensemencé notre bloc de plâtre au moyen de notre levure provenant des cultures sur moût de bière. Nous avons refermé notre cristallisoir et porté l’appareil à l’étuve à -+ 270. Au moyen de cette méthode les levures, qui possèdent la propriété de former des ascospores, ont sporulé, dans la plupart du temps après une trentaine d’heures.

En ce qui concerne notre organisme, les examens effectués après 30 et 40 heures et après 3,5 et 15 jours ne nous ont jamais permis de trouver des formes ascosporées.

Ne nous en tenant pas à ce seul procédé, nous avons aussi tenté la même opération en nous servant du milieu spécifique de GoRoDKOwA. Nous avons préparé le milieu de culture suivant :

HaANTSETIÉS PARENTS RS Ac DEOO ETS Gélose een. AMICEN ETES US ES Reptoe te nee Ne NET re te TX gf:

Bouillon de viande ...... ne NN EI Chlorurerde sodium. ua O gr. 5 (HUCOBE DCR UE de er ee SP ONE. 2A

Nous avons ensemencé sur ce substrat notre levure, elle végète assez bien durant les premières heures sur ce milieu, mais au bout du troisième jour, nous ne constatons pas de progrès dans sa croissance; les examens microscopiques effectués à diverses périodes ne nous ont jamais permis de découvrir des asques et des ascospores.

De l’ensemble de nos constatations nous pouvons conclure que notre organisme doit être rattaché suivant la classification de GUILLIERMOND à la famille des Non-Saccharomycèlées et au genre Cryplococcus de KüTZING-VUILLEMIN. Cette espèce est d’un beau rose, surtout sur les milieux maltosés; la teinte varie suivant la température et la composition des milieux de culture; elle se rapproche par sa coloration du Crypiococcus salmoneus (1907) et du Cryptococcus Barnier (1906) tous deux déjà décrits par A. SARTORY et BAINIER. Elle diffère par sa forme et sa couleur du Cryptococcus gluhins. Nous proposons pour la désigner le nom de Cryplococcus corallinus.

Pouvoir pathogène: L'action pathogène expérimentale a été examinée sur des souris blanches et des cobayes. Ces essais nous ont paru nécessaires étant donné l’origine du champignon isolé au niveau de lésions rappelant les kérions trichophytiques. Le liquide d’inoculation a été obtenu par émulsion d’une ôse de culture dans 5 cc. de sérum physiologique.

Trois souris blanches ont été inoculées au moyen de 3 ce. de cette émulsion; les animaux n’ont montré aucun

signe pathologique; ils ont tous survécu. La même épreuve pratiquée sur deux cobayes au moyen de 5 cc. d’émulsion de levure n’a amené aucun symptôme de maladie et ces animaux eux aussi ont survécu à l’inoculation.

Nous avons aussi essayé la contamination de souris et de cobayes par étalement de la levure sur le derme légèrement scarifié au moyen de papier de verre; les petites lésions formées par ce procédé n’ont pas évolué vers l’infection; elles se sont fermées très rapidement et spontanément. Ces expériences montrent par conséquent que l’espèce n’est pas pathogène et que l’on ne peut pas lui imputer les lésions constatées chez l’homme.

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