CHAPITRE II

Étude morphologique et biologique du Cryptococcus radiatus

Ses caractères culluraux et biochimiques

10 Origine :

L'organisme que nous décrivons ici a été, comme le précédent, isolé dans le laboratoire du professeur A. SARTORY (81) à partir de cheveux envoyés par le docteur HUFSCHMrrr. Ces poils provenaient de prélèvements opérés sur les membres d’une congrégation religieuse du Haut-Rhin, à la suite d’une véritable épidémie de chute des cheveux.

Les cheveux ont été coupés en petits fragments au moyen desquels nous avons pratiqué des ensemencements sur les milieux usuels, qui ont donné des cultures d’un organisme, que nous décrivons ci-dessous :

29 Examen microscopique des cultures en goutte pendante : Ces cultures ont été effectuées dans la chambre humide de VAN TIEGHEM:; on a utilisé comme milieu de culture le moût de bière; au bout de 48 heures on constate la croissance du champignon et l’examen microscopique montre de grosses cellules généralement rondes; la forme ovale est exceptionnelle; elles sont tantôt isolées tantôt bourgeonnantes; lorsque ces éléments cellulaires bourgeonnent, les bourgeons se {rouvent très souvent au nombre de deux du même côté; certaines formes sont groupées en chaînettes et elles peuvent atteindre le nombre de 5 à 6 éléments. Les dimensions de ces éléments sont de 2 à 4 w de diamètre. Les bourgeons arrivant à s’individualiser à un certain stade, grossissent et poussent eux-mêmes des bourgeons nouveaux. Jamais dans ces différentes cultures en cellule nous n’avons pu mettre en évidence des formes ascosporées.

3° Colorations : Pour vérifier les données que nous avons obtenues dans nos cuitures en chambre de VAN THIEGHEM, nous avons effectué des examens de la levure après coloration vitale au rouge neutre, au sudan III, par la méthode de SASAKAWA, par celle de SCHUMACHER. Toutes ces préparations nous ont donné encore à ce point de vue des résultats concordants : nous n’avons jamais mis en évidence des asques et des ascospores.

4° Caractères culiuraux : (Fig. 5)

Nous avons ensemencé notre organisme sur les milieux suivants solides et liquides : Milieu de SABOURAUD, maltosé et glucosé, pomme de terre, carotte, jus de pomme de terre gélatiné, gélatine, albumine d’œuf, banane, pomme de terre glycérinée, bouillon de viande, bouillon de viande glycériné, liquide de RAULIN neutre, acide, glucosé, eau de malt, moût de bière. La plupart des cultures ont été placées à + 220 température très favorable pour l’espèce considérée comme on le verra dans la suite de notre exposé. Toutefois, nous avons disposé certaines cultures à des températures comprises étre LES et ESS

Avant de décrire en détail les caractères culturaux de cette espèce sur chacun des milieux utilisés, nous signalerons quelques caractères de culture qui sont essentiels et généraux. Sur tous les milieux usuels la culture est rapide (1 à 2 jours environ); elle présente un aspect luisant; l’enduit formé est peu épais et il envahit la totalité du substrat nutritif en moins de trois jours; la culture est d’un beau rose; la teinte est plus claire que celle de Cryptococcus corallinus, que nous avons décrit dans le précédent chapitre. Le dépôt formé dans les réservoirs des tubes de RoUx est très abondant. Contrairement à ce que nous avions constaté pour le Cryptococcus corallinus (ne cultivant à partir des poils qu’à une température de + 379), ici nous obtenons des cultures toutes semblables entre elles à des températures de + 180, + 220, + 25°, + 270. Klles sont toutes luisantes, peu adhérentes au milieu et elles ne se plissent jamais. Rappelons ici que les cultures du Crypiococcus corallinus étaient toutes plissées et que dans certains cas ces plissements prenaient un développement très exagéré. La coloration est toujours la même, tirant sur le saumon clair.

Culture sur milieu de Sabouraud: A + 370 nous ne constatons pas de développement au bout des premières quarante-huit heures; ce n’est que le quatrième jour après l’ensemencement que se forment des colonies d’abord roses, ponctuées qui s’étalent plus largement ensuite: elles sont très lisses et arrivent à un moment à donner des festons réguliers assez accentués; signalons ici un détail qui a son importance pour la diagnose : à la périphérie les zones sont bien roses, au centre la teinte est beaucoup plus pâle; la partie centrale est mamelonnée, toujours très lisse, mais elle s’épaissit chaque jour davantage.

À + 270 ou à la température du laboratoire, la culture se fait beaucoup plus vite; le deuxième jour après l’ensemencement on peut déjà constater la formation des colonies; par la suite elle devient très luxuriante et les diverses colonies formées se réunissent pour donner une vaste bande lisse, rose, à bords festonnés.

L’examen wicroscopique pratiqué avec et sans coloration nous montre des cellules levures essentiellement rondes, bourgeonnantes la plupart du temps; ces éléments mesurent de 2 à 3 y de diamètre. (Fig. 2)

Si on effectue l’ensemencement sur de grandes boîtes de PÉTRI de façon à produire la formation de colonies géantes, l’organisme donne dans les premiers jours de petites colonies se rejoignant bientôt pour former un tapis homogène. À un certain stade les bords sont légèrement festonnés, puis par la suite un phénomène assez curieux est constatable : il apparaît à la périphérie du tapis ainsi formé des prolongements qui se développent de plus en plus, simulant dans certains cas l’allure générale d’une araignée, quelquefois ressemblant à des mille pattes ; de toute façon ces prolongements se forment constamment et affectent la forme des épines de certains radiolares. (Fig. 4)

Milieu de pomme de terre: Sur ce milieu, à la température de + 249 après 48 heures d’ensemencement, la culture évolue très favorablement: mais ici il faut signaler une différence notable avec celle que nous venons de décrire sur le milieu de SABOURAUD : la culture sur pomme de terre est loin d’être lisse: elle est tout à fait mate, pas du tout luisante

et par ces caractères elle semble se rapprocher du Cryptococcus corallinus ; assez souvent même, la culture revêt un aspect poussiéreux, plâtreux surtout à la partie supérieure du substrat; elle n’apparaît un peu luisante qu’au voisinage immédiat du réservoir du tube de ROUX, c’est-à-dire dans les régions d'humidité maxima. La culture est élevée au centre, formant une sorte de petite langue semée de très légers vallonnements; les bords sont festonnés et souvent très contournés. La pomme de terre est totalement couverte par le tapis levurien après un temps variant entre quinze et dix-huit jours; la zone supérieure est toujours plâtreuse et malgré nos nombreux examens effectués sur des prélèvements faits en diverses régions du tube, ni sur ce milieu, ni sur le substrat précédent, jamais nous n’avons pu constater la présence d’asques, ni d’ascospores, bien que dans certains cas nous ayons attendu très longtemps pour faire nos préparations. À l’examen microscopique on voit toujours de grosses cellules rondes ou ovales tantôt isolées, tantôt bourgeonnantes; souvent ce bourgeonnement se fait deux fois sur le même côté; certaines formes se présentent en chaînettes de trois, quatre, cinq ou six éléments.

Sur carotte la culture est très luxuriante, ne s’épaissit pas et forme un tapis rouge d’une épaisseur uniforme, lisse sans ph; en cinq à huit jours tout le milieu est envahi. Sur gélose et gélatine la culture est satisfaisante.

Sur banane, pomme de terre glycérinée nous constatons la formation de cultures assez luxuriantes.

Nos ensemencements pratiqués sur les milieux liquides nous ont donné les résultats suivants :

Sur liquide de RAULIN nous assistons à la formation d’un voile dont nous avons essayé de fixer les conditions d’apparition : À la température de + 15° le voile ne se forme pas; à + 209 un voile rose apparaît au bout d’une période de quatre jours; à 24° le voile rose est constatable au bout de deux jours; à + 349 ainsi qu’à <- 370 il n’y a pas formation de voile. Lorsqu'il se forme, ce voile est léger, rosé, fragite et non plissé; il tombe rapidement au fond du tube de culture.

Dans le bouillon il se forme au bout de deux jours un léger voile, qui, par la suite, ne tarde pas à tomber au fond

du tube où il constitue un dépôt peu abondant. Ce milieu ne

paraît aucunement favorable pour la culture de notre Crypiococcus.

Sur moût de bière la culture est très avancée déjà après 24 heures d’ensemencement: le voile s’épaissit par la suite: il est résistant; en même temps qu’il se forme, au fond du

tube se dépose une certaine quantité de culture; le dépôt devient très abondant au bout de six à huit jours.

Propriétés biologiques : L’optimum cultural qui a d’abord été l’objet de nos préoccupations a été recherché au moyen de cultures effectuées sur moût de bière et sur milieu de RAU- LIN; nous les avons disposées à différentes températures comprises entre + 10° et + 40°. Nous avons constaté le maximum de croissance et obtenu les meilleures récoltes pour les températures comprises entre + 220 et + 250. À + 409 nous ne constatons plus aucune croissance de même qu'au 120,

Ici aussi comme pour l’espèce précédente nous avons employé, pour déterminer la concentrahion optima en ions H des milieux de culture, le moût de bière; la mesure de la concentration en ions H des divers milieux a été effectuée en se servant du potentiomètre et de l’Aectrode à antimoine. Une série de tubes renfermant le milieu a été utilisée pour constituer une gamme de pH croissants depuis pH—4 jusqu’à pH=—9. Chacun des tubes ainsi traité a été ensemencé et placé à la température de + 229. Nous avons examiné chacune de ces cultures après un temps qui pour une série était de 48 heures, pour l’autre gamme de 4 jours de culture; les cultures ont été traitées suivant la technique que nous avions employée pour le Cryptococcus corallinus. Nous avons obtenu la meilleure récolte pour les milieux amenés à pH—6,3. Les limites de croissance sont fixées pour les pH=—7,2 et 5,5.

Nous avons en même temps effectué des mesures pour étudier l’influence de la concentration des milieux en ions H sur la production du pigment; nous les relatons dans le chapitre ayant trait à l’étude des pigments des deux C7ypto- COCCUS.

Nos essais concernant l’action de la lumière sur la levure en expérience nous ont permis la conclusion que les rayons

lumineux n’avaient aucune influence marquée sur la crotssance de notre organisme à condition de rester dans les limites de températures observées.

Propriétés biochimiques : La même technique que nous avons énoncée à propos de notre première champignon, a été appliquée ici même; nous croyons inutile d’en rappeler les différentes modalités : nous nous contenterons de mentionner ici les résultats obtenus.

Le milieu renfermant l’azote à l’état de sel ammoniacal (en l’espèce du sulfate d’ammonium) est de beaucoup plus favorable que le milieu nitraté. Sur ce premier milieu l’examen microscopique permet de voir des formes levures absolument comparables à celles qui se produisent sur le milieu de SABOURAUD ou le moût de bière ; nous n’avons pas obtenu de formes de souffrance alors que nous devons signaler une tendance très marquée de notre organisme vers ces formes de souffrance, lorsqu'il est cultivé sur le milieu nitraté. En outre, sur le milieu ammoniacal la végétation se fait beaucoup plus vite et la culture acquiert une luxuriance que nous ne retrouvons jamais sur le premier milieu.

Action sur les sucres : Ie milieu de base a été aussi ici le liquide de RAULIN dépourvu de sucre, dans lequel nous avons ajouté, pour chaque expérience, le sucre à étudier : glucose, lévulose, galactose, mannose, saccharose, maltose et lactose. Ces milieux préparés avec tout le soin nécessaire pour éviter toute interversion, nous avons pris la précaution d'établir des tubes témoins, qui, eux, n’ont pas été ensemencés, mais soumis à toutes les conditions des tubes réservés à la culture de notre organisme. Des dosages ont été pratiqués dans ces divers tubes témoins, afin de déceler toute interversion qui aurait pu se produire. Pour contrôler lPassimilation des sucres par la levure, nous avons fait usage de la méthode de BERTRAND.

En outre, nous nous sommes adressé au tube B de BESSON, RANQUE et SENEZ pour déterminer la réduction du rouge neutre, les phénomènes d’alcalinisation ou d’acidification du milieu, la production ou l’absence de gaz et l’approximation de la quantité de gaz formée.

Dans ces conditions nous avons constaté que l'espèce envisagée ne réduisait pas le rouge neutre. Vingt-quatre heures après l’ensemencement il se produit un virage du milieu vers la teinte amarante ce qui est l’indice d’une acidification du milieu; en aucun moment le tube à hémolyse n’a quitté le fond du grand tube de culture et constamment il est resté complètement rempli du liquide nutritif. Ce qui dénote donc l’absence de gaz.

La recherche de l’acide lactique effectuée suivant le même procédé déjà décrit à propos du Cryptococcus corallinus (réactif d’UFFELMANN) nous a donné des résultats positifs. Aucune fermentation gazeuse, ni production d’alcool n’ont été mises en évidence. La dégradation du glucose par la levure expérimentée se passe donc suivant le même processus que pour le Crypiococcus corallinus. Pour les autres hydrates de carbone nous avons utilisé la même technique et pour avoir une idée de l’assimilation de ces substances par notre levure nous avons eu recours à des dosages au moyen de la méthode de BERTRAND. Ces dosages expriment les quantités de sucres disparues des milieux du fait de la culture de notre microorganisme. Le phénomène est noté dans le tableau suivant par le signe +; sont importance quantitative est exprimée par la quantité disparue pour 100.

Saccha-

ASS 0 IPASS. 71PASS 7 PASS 00) EASS 0" ASS AP PASS 0 IN ASS. + 3,62 | + 1,03 Oo oO O0 oO + 2,26| + 2,21 O0 +

On voit nettement en consultant le précédent tableau que notre organisme n'utilise pas le galactose, le mannose et le lactose. Le lévulose est un sucre qui n’a qu’un intérêt médiocre pour la nutrition de notre champignon.

Le glucose, la saccharose et le maltose sont de bons aliments, qui favorisent la croissance de notre espèce. En ce qui concerne la pigmentation aucune modification appréciable n’a été constatée. L'apparition de la coloration se fait au bout des mêmes temps et avec la même intensité.

Action sur les matières azotées : Recherches sur les propriétés protéolxtiques : Notre levure a été ensemencée tout d’abord sur des tubes renfermant du sérum coagulé; les cultures ont été disposées à + 220: la poussée de l’organisme sur ce milieu est de beaucoup moins luxuriante que sur milieu de SABOURAUD, pomme de terre et carotte; elle débute par des points roses à bords lisses s’élargissant peu à peu. À la température de + 370 la poussée est ralentie, mais l’organisme reste d’un beau rose saumon (rappelons ici que dans ces conditions le Cryptococcus corallinus étudié précédemment prend une teinte blanche) . Après un mois de culture aucun phénomène de liquéfaction du sérum n’a été constaté.

Nous avons ensuite ensemencé notre levure sur a/bumine d'œuf : le milieu était disposé en petits cubes dans du bouillon de bœuf; on constate la formation d’un faible voile peu résistant; jamais l’abumine d'œuf n’a été liquéfiée: nous n’avons non plus constaté aucune attaque de cette substance par la levure.

Des ensemencements ont été ensuite pratiqués sur gélatine et les cultures disposées à + 180. Après un mois de séjour à cette température aucune liquéfaction du milieu n’a pu être mise en évidence.

Les cultures effectuées sur des tubes contenant du lait tournesolé, à la température de + 180, nous ont donné les résultats suivants : Le lait n’est pas coagulé, même après vingt jours de culture.

Cultures sur milieux spéciaux pour favoriser la production des ascospores : Notre espèce, après avoir subi un rajeunissement par repiquages répétés sur moût de bière, a été ensemencée d’une part sur des blocs de plâtre et de l’autre sur milieu de GORODKOWA. Sur ces milieux nous avons opéré des prélèvements après 30, 40 heures et après 3, 5 et 15 jours. Nous avons effectué à partir du matériel des préparations microscopiques , celles-ci ont été examinées avec le plus grand soin; en aucun cas nous n'avons décelé des asques et des ascopores.

Si nous nous rappelons les diverses données fournies par l’examen microscopique, les propriétés de l'organisme sur les différents milieux de culture, ses caractères biolo-

giques et biochimiques, nous sommes en droit de le ranger selon la classification de GUILLIERMOND dans la famille des Non-Saccharomycétinées et dans le genre Cryptococcus Kutzing- Vuillemin. Par ses dimensions et son aspect cultural, en même temps que par ses propriétés biologiques, la levure étudiée se distingue du Cy7ypiococcus salmoneus. Nous proposons pour la désigner le nom de Cryptococcus radiatus, en égard à son aspect sur milieu de SABOURAUD en boîtes de PÉTRI.

Pouvoir pathogène: I/action pathogène expérimentale de cet organisme a été examinée par des inoculations intrapéritonéales et des étalements sur le derme légèrement scarifié au moyen de papier de verre . Les animaux qui nous ont servi pour nos expériences sont : le cobaye et la souris. Ces essais ont été pratiqués sur deux cobayes et 2 souris blanches. Aucun phénomène pathologique ne s’est produit et les animaux ainsi traités sont restés bien portants : ce qui nous fait conclure à la non-pathogénéité du Cryplococcus radratus.

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