CHAPITRE IV

Essais d’isolement des deux pigments

Méthode bhysique de GOoPPELSRŒDER (84) basée sur Panalyse capillaire :

Nous avons fait appel à cette méthode afin d'examiner aussi vite que possible si nos pigments correspondaient à une ou à plusieurs substances colorantes. Un autre avantage de cette méthode nous a séduit : on peut facilement obtenir le colorant à l’état de pureté en découpant les bandes d’absorption dans le papier capillaire employé. On peut de plus obtenir les pigments à un état assez pur pour les contrôler au point de vue spectroscopique. Nous avons effectué cette analyse selon toutes les données nécessaires pour empêcher les altérations et les causes d’erreur.

Etant donné l’insolubilité des pigments étudiés nous avons opéré selon les principes indiqués par FRENKEL (85) : des raclages de culture sur milieu solide ont été pratiqués et les cellules levuriennes soumises à l’action d’une solution hydro-alcoolique alcalinisée faiblement au moyen de la soude; le tout a été introduit dans des tubes à essai fermés au moyen d’un capuchon en caoutchouc avec les bandes de papier filtre coupées dans le sens de la longueur des fibres, de 2 centimètres et demi de largeur et de trente centimètres de longueur. Celles-ci ont été suspendues librement à l’intérieur des tubes; après 24 heures l’ascension du solvant et du pigment avait atteint son maximum et à ce moment on prélève les bandes; on les sèche et on les utilise pour l’examen.

À l’aide de cette méthode nous avons pu constater que dans les deux cas nous avions affaire à une substance chromogène unique; d'autre part , examinées spectroscopiquement, nous avons vu que le pigment du Cryplococcus corallinus ne

possédait cette fois-ci que quatre bandes d’absorption, qui correspondaient aux longueurs d’onde suivantes: 620, 580, 520 et 400.

Méthode chimique d'isolement :

Etant donné la non-diffusibilité du colorant dans le milieu ambiant pour les deux champignons étudiés et vu la proche parenté botanique de ces espèces avec le C7yptococcus salmoneus nous avons tout d’abord essayé d'isoler les pigments suivant les techniques employées par notre cher maître lors de l’étude de sa levure. On a fait usage comme solvant des produits couramment employés dans ce but et qui ont réussi pour l'isolement du pigment du Cryptococcus salmoneus.

Les pigments des deux levures sont cependant non solubles dans l’alcool méthylique, dans l’alcool éthylique, dans l’éther, dans l’acétone, le chloroforme, la benzine et le sulfure de carbone, ce qui différencie nettement nos deux organismes du Cryplococcus salmoneus.

C’est pour ces raisons d’insolubilité dans les solvants employés ordinairement en chimie biologique que nous avons été obligé d’avoir recours à d’autres méthodes.

La technique de THUMM (86) ainsi que celle de GRIMBERT- LASSEUR (87) employées pour les bactéries ne pouvait pas nous donner satisfaction vu qu’elles s’adressent à des microorganismes chromopares ou parachromopares, dont le pigment diffuse dans le milieu ambiant et est ordinairement soluble dans l’eau.

La méthode d’isolement utilisée par WILLSTÆTTER (88) et son école en ce qui concerne l’extraction des pigments anthocyaniques, basée sur une hydrolyse préalable au moyen de lacide sulfurique ou de l’acide chlorhydrique et épuisement du milieu hydrolysé par agitation avec l’alcool amylique ne nous à pas donné non plus des résultats positifs.

Nous avons alors eu recours à la technique par absorption en triturant et en broyant les corps levuriens avec du sable purifié ou avec d’autres substances inertes et en épuisant ensuite la pâte ainsi obtenue au moyen de différents solvants; le résultat fut encore négatif.

Une autre méthode essayée par nous a été celle de FRESENIUS (89) passé dans le domaine classique pour l’analyse alimentaire en ce qui concerne les produits farineux ou les œufs en conserve. Les produits à examiner sont traités tout d’abord avec de l’éther, ensuite épuisés par l’acétone; le liquide acétonique obtenu est ensuite traité au moyen d’acide acétique ou d’alcool à 95°; dans la solution acide il est possible de fixer le colorant sur de la laine; le liquide alcoolique est employé pour des recherches réactionnelles vis-à-vis des acides et des bases, ainsi que pour les phénomènes de réduction et d’oxydation. Cette technique ne nous a pas permis d'isoler les pigments.

Au cours de nos analyses d’hydrolyse pour la recherche des anthocyanes nous avons observé un phénomène qui finalement nous a mis sur la bonne voie. En effet, si on emploie une émulsion levurienne dans de l’eau distillée acidulée au moyen de l’acide chlorhydrique en vue de l’hydrolyse et si on a recours ensuite à une solution basique concentrée au lieu d'alcool amylique, on observe l’apparition d’une teinte brun jaunâtre dans la solution aqueuse et les corps mycosiques se décolorent. C’est ce phénomène qui nous a amené à employer la méthode de RoTA (90) pour la différenciation des divers pigments.

100 grammes d’éléments levuriens pesés à l’état humide ont été émulsionnés dans 200 cc. d’eau distillée; à cette émulsion nous avons ajouté 5 grammes d’acide chlorhydrique concentré et 5 grammes d’une solution à 10 % de chlorure d’étain. Cette dernière solution est préparée extemporanément par dissolution de l’étain dans de l’acide chlorhydrique. Le mélange est vigoureusement agité, puis chauffé pendant 15 minutes au B. M. à 1000.

D'autre part nous employons la même émulsion levurienne en introduisant uniquement de l’acide chlorhydrique. En comparant les deux échantillons mis en réaction nous n’avons pas pu constater aucune différence. T1 s’agit donc de substances chromogènes non réductibles.

Une émulsion levurienne toujours de même concentration acidulée par l’acide chlorhydrique et chauffée au B. M. a été ensuite alcalinisée par une solution de soude à 20 %; par ce

procédé nous constatons, comme nous l’avons déjà mentionné antérieurement, une activation de la coloration dans la solution aqueuse.

D’après la classification de RoïTaA les substances chromogènes ayant ces propriétés doivent être rangées dans le groupe des colorants dérivés de l’oxyanthraquinone que cet auteur fait entrer dans la quatrième classe de sa systématique.

Dans cette classe RoTA distingue entre les colorants dérivés du diphénylméthane non amidé et les substances dérivés de l’oxyanthraquinone, dont la plus grande partie constituent des colorants organiques naturels.

Le diphénylméthane est un hydrocarbure qui donne par oxydation une cétone : la benzophénone. Le di-amino-tetraméthylate de la benzophénone sert de matière première à la synthèse du seul colorant de ce groupe employé dans la technique des colorations. Il est désigné sous le nom d’awramine.

Le groupe chromophore de ces colorants est le suivant :

En ce qui concerne les matières pigmentaires dérivées des oxycétones le groupe chromophore est constitué comme suit :

On réunit dans ce groupe des colorants assez hétérogènes qui sont cependant d’une constitution assez semblable : les deux représentants les plus connus de ce groupe sont : l’alizarine qui est une di-oxy-anthraquinone et la purpurine qui est une #r1-0xy-anthraquinone ; comme colorant organique naturel du même groupe on peut signaler encore le carmin.

a if

Afin de caractériser plus profondément la substance chromogène obtenue ainsi en solution aqueuse, nous avons effectué les essais suivants : une partie de la solution a été évaporée dans le vide sulfurique jusqu’à concentration sirupeuse; à l’aide de ce produit nous avons effectué une solution alcoolique dans laquelle nous avons ajouté quelques gouttes d’une solution de perchlorure de fer à 1 pour 1000. La teinte rouge brun de la coloration initiale passe au vert olive; cette réaction nous permet de ranger notre substance colorante dans le groupe des oxycétones, car les colorants du groupe dérivés du diphénylméthane ne réagissent pas avec le perchlorure de fer. D’autre part les colorants de ce groupe sont ordinairement directement solubles dans l’eau et se fixent électivement sur la laine, sans qu’il soit nécessaire d’opérer un mordançage préalable. Nous avons vu que nos pigments sont, à l’état natif, insolubles dans l’eau et ne colorent pas la laine sans mordançage. Nous nous croyons par conséquent en droit de ranger les deux pigments isolés de nos levures dans le groupe des dérivés oxycétoniques.

Dans le but de déterminer plus étroitement la place de ce colorant, nous avons, à l’aide de nouvelles solutions préparées en partant de levures émulsionnées dans l’eau et traitées par un alcalin, continué nos recherches.

La solution aqueuse alcaline possède une teinte initiale rouge brun. Si on filtre pour séparer les éléments levuriens du liquide et les substances protéiniques ayant pu passer dans la solution, et si l’on ajoute de la potasse en excès, la teinte rouge brun passe au rouge violet, ce qui nous permet de ranger nos substances chromogènes parmi les di- ou ér1-cétones étant donné que les mono-cétones présentent à cet état des colorations jaunes où jaune rougeâtres.

La réaction suivante nous a en outre permis de vérifier cette constatation : la solution alcaline initiale traitée au moyen d’acide chlorhydrique en excès ou avec de l'acide acétique précipite de la solution aqueuse le chromogène acide du colorant sans détruire cette substance . Les dérivés mono-cétoniques des oxyanthraquinones par contre se décomposent par cette réaction ({benzophénones) ou se colorent d’une manière intensive en jaune {flavones, quercétines).

Cette solution précipitée agitée avec de l’éther abandonne la substance chromogène au solvant organique, ce qui indique que nous avons affaire avec un oxyanthraquinone non sulfoné, avec le groupe chromophore :

PR COL >co

DE

Ceci est aussi en accord avec nos constatations lors de l’étude sur l’apparition du colorant dans les différents milieux de culture, alors que nous examinions l’influence des différentes substances minérales sur l’apparition du pigment. Nous avons pu constater que le pigment apparaissait même en l’absence de l’élément soufre, ce qui confirme nos résultats chimiques.

Ayant ainsi assigné une place, dans la systématique des colorants naturels, à nos pigments, nous avons pu démontrer qu’ils entrent dans la classe des oxyanthraquinones à noyau dicétonique non sulfoné.

Nous nous sommes ensuite livré à l’analyse élémentaire de notre substance de manière à vérifier ces faits.

Analyse élémentaire : Pour mener à bien cette analyse élémentaire, nous nous sommes adressé à la solution alcaline dont nous avons parlé plus haut; nous avons précipité la substance chromogène dans cette solution par l'addition d’acide chlorhydrique. Nous avons traité ce précipité par l’éther; il se dissout dans ce solvant. La solution éthérée a été ensuite soumise à l’évaporation et nous obtenons enfin une matière fortement colorée en jaune rougeâtre. C’est ce produit qui nous a servi pour notre analyse élémentaire : Les essais nombreux que nous avons effectués nous ont démontré la présence de carbone, d’hydrogène et enfin d’oxygène ; en aucun cas nous n’avons pu mettre de l’azofe en évidence.

Le produit résultant de l’évaporation de la solution éthérée a été expérimenté au bloc Maquenne afin de déterminer le point de fusion et le point de carbonisation. Le produit supporte sans altération une chaleur de 230° à 2359, Le point

de fusion est situé à 2449 à 2450; à cette température la fusion s’opère instantanément. La sublimation s’opère sans altération. Chauffé jusqu’à la carbonisation en présence de sodium nous n’avons pas pu observer d’odeur de phénol ; par contre on perçoit une odeur de pyrocathéchine où d'amandes amères:; le charbon repris par l’eau donne une solution dans laquelle la recherche des cyanures a été négative. Ce qui prouve lPabsence de l’azote dans notre produit.

L'analyse élémentaire effectuée sur trois échantillons différents toujours à l’aide du même produit employé à des doses différentes nous à donné en moyenne pour 100:

Le poids moléculaire a été déterminé par la méthode cryoscopique sur une solution aqueuse alcaline, dont le titre de KOH était de 1 %. Sachant que la constante d’abaissement du point de congélation de la solution aqueuse alcaline déterminé à l’avance était de À — 0,3426, la difiérence de la valeur des deux /\ nous a permis de calculer le poids moléculaire de la substance. Nous avons employé une solution renfermant 1 % du colorant.

Pour calculer le poids moléculaire nous nous sommes adressé à la formule :

K Pm — KC

 L’abaissement du point de congélation de notre solution

a été mesuré et nous a donné /\ = 0,3937.

Sachant que l’abaissement du point de congélation de notre solution de potasse à 1 % est de 0,3426, nous avons calculé l’abaissement du point de congélation dû au colorant dissous soit :

À = 0,3937 —0,3426 = 0,0511 Si donc nous calculons le poids moléculaire en nous

servant de la formule précédemment exposée nous avons :

Pm — — 306 0,0511

Nous avons fait les mêmes mesures au moyen de la matière colorante obtenue par épuisement de la solution acide primitive par l’éther. Nous avons mesuré l’abaissement du point de congélation d’une solution renfermant 1 °, de cette substance chromogène. Le calcul du poids moléculaire nous a donné : 294. Par conséquent la diminution de valeur de ce poids moléculaire correspond à une différence de 72. Tenant compte de ce que nous avons affaire tout d’abord à la matière colorante à l’état hydraté, ensuite à la matière colorante déshydratée, nous nous croyons en droit de rapporter la différence de la valeur des poids moléculaire = 72 à l’eau de cristallisation. Le poids moléculaire de l’eau étant de 18, le chiffre de 72 correspondrait par conséquant à 4 H10.

Ayant constaté antérieurement par les réactions chimiques que nous étions en présence d’un dérivé oxycétonique dont nous connaissons le groupe chromophore, comme équivalent à la formule C4 H$ Of (alizarine ou hystazarine), nous savons que le poids moléculaire de ces deux corps équivaut à 240. Le poids moléculaire de notre substance chromogène déshydratée étant de 294, la différence entre ces deux poids moléculaires est de 54. Ce poids pourrait s’appliquer à un noyau de C* HS ayant la même valeur moléculaire. Nous aurions par conséquent affaire à un corps dont nous pourrions nous représenter la structure chimique de la façon suivante :

CHSCT CO LC CO PSC NS AT CZ.

CHOSE Qi