CHAPITRE V
Recherches sur les propriétés physiques des pigments
À. Analyse spectroscopique :
Les recherches spectroscopiques ont été pratiquées au moyen de plusieurs liquides de concentration différente :
Lors de l’étude des conditions d’apparition des pigments, nous avons eu l’occasion d’indiquer les bandes d’absorption que nous avons notées à l’examen par le microspectroscope de ZEIsS, bandes observées sur l’organisme même. Ces bandes ont leur maximum d'intensité aux longueurs d’onde suivantes :
Toutes ces bandes ont été toujours observables sur le Cryptococcus corallinus, tandis qu’en ce qui concerne le Cryptococcus radiatus nous avons très souvent observé seulement 3 ou 4 bandes. Ce fait nous ayant frappé, nous avons cultivé le Cryptococcus corallinus sur un milieu à un pH initial de 7,2. I/examen microspectroscopique a été alors effectué le quatrième et le cinquième jour de la culture, alors que l’apparition du pigment faisait encore complètement défaut. Cette analyse nous a alors permis de constater que la levure présentait, même à l’état achromogène, un spectre caractéristique avec des bandes au nombre de 4 dont le maximum d'intensité correspondait aux longueurs d’onde suivantes :
a = 6035 À, b = 5640 À, c — 5480 À, d = 5190 À. Si nous comparons le résultat ainsi obtenu avec le résultat antérieur (levure chromogène) on note que les quatre bandes
de la levure en apparence achromogène correspondent à peu près avec quatre bandes du spectre de la levure pigmentée. On observe un léger décalage pour 5645 et surtout 5200.
Nous avons effectué des expériences analogues en plaçant l’organisme levurien dans une atmosphérique de gaz carbonique (ce qui ne nuit pas à l’énergie vitale du Cryptococcus). En soumettant l’organisme ensuite aux mêmes analyses spectroscopiques le spectre ne donne plus de bandes d’absorption. En présence de ce phénomène, nous nous sommes rappellés des beaux travaux de KEILIN (01) en Angleterre et de FISCHER (92) en Allemagne. Ces auteurs ont pu démontrer l’existence d’un pigment respiratoire intracellulaire commun aux microorganismes, aux plantes et aux animaux qu’ils ont dénommé cytochrome et dont le spectre présente quatre bandes qui ont été fixées pour les muscles thoraciques de l’abeille à :
Pour le bacille subtilis à :
al=10032}br=u5s000méc =1255027 d =IS210;
Pour la levure des boulangers à :
aï=06035,.b =16645 e —45490 dù45 190:
Nous voyons donc que nos quatre bandes d’absorption observées à la microanalyse de la levure Crypéococcus corallinus à l’état achromogène sont tout à fait comparables à celles constatées par KEILIN et FISCHER sur des organismes très divers. Nous avons donc, dans notre levure, affaire avec un organisme très aérophile et des sept bandes d'absorption constatées antérieurement, il n’y a que trois bandes différentes imputables au pigment rouge même. Cependant en examinant notre levure chromogène après lavoir placée pendant 48 heures dans une atmosphère de gaz carbonique, nous pouvons constater à l’examen microspectroscopique encore la présence de quatre bandes situées à :
a — 6220, b — 5800, c — 5200 et d — 4900.
La bande d est toujours très faible, difficilement fixable. Quand à la bande c — 5200, nous voyons que chez la levure en aérobiose elle correspond à la bande f; chez la levure achromogène elle correspond à la bande d située à 5190. Ily a
donc chez la levure normale et chromogène superposition des deux bandes appartenant à deux pigments différents coëxistants simultanément. Ceci permet d'expliquer le fait mentionné lors de l’étude de la levure même suivant lequel cette bande a toujours un aspect estompé.
Le pigment purifié a été examiné en solution aqueuse alcaline à une concentration de 0,1 % et à un pH de 8,6, sous une épaisseur de 10 millimètres, le pigment donne les bandes d’absorption suivantes :
À — 630 à 610 avec un maximum d'intensité pour À — 622
Une deuxième bande d’absorption plus large est située centre.
À = 590 et À — 560 avec un maximum pour À — 580
La troisième bande d’absorption s’étend entre :
À = 523 et À — 517 avec son maximum d’intensité à À — 520
La quatrième bande très faible est mal délimitée a son maximum d'intensité à À — 480. (Fig.6)
La solution éthérée obtenue par épuisement de la solution hydrolysée a été évaporée et le résidu pesé a été dissout dans une solution aqueuse de pH — 5,6; la concentration mesurée par double pesée du résidu était de 0,032 %. La solution présentait une teinte jaune citron; examinée spectroscopiquement sous une épaisseur de 70 millimètres, donnait une absorption totale à partir de À — 500. (Fig. 7)
Une troisième solution hydroalcoolique a un pH acide de 5,6, possède une teinte orangé jaune et donne à l’examen spectroscopique sous une épaisseur de 30 millimètres les bandes d’absorption suivantes :
La première très bien limitée entre 618 et 616; la deuxième s'étend entre À — 600 et À 570 avec son maximum à 580. Une troisième donne une absorption totale à partir de À — 510. (Fig.8)
La solution éthérée même à une concentration de 1 % donne une absorption totale à partir de À — 400. (Fig.0)
Le pigment isolé du Cryptococcus radiatus nous a montré au spectroscope des bandes d’absorption absolument comparables à celles obtenues avec le Cryptococcus corallinus chromogène et placé pendant 48 heures dans une atmosphèrede gaz carbonique, c’est-à-dire avec les bandes caractéristiques du pigment oxycétonique.
Les différentes solutions que nous avons soumises à l'examen spectroscopique ont été examinées au point de vue de la fluorescence à la lumière de Woop dans les rayons ultra-violets.
Le pigment en solution aqueuse alcaline légèrement violette à la lumière du jour ne présente, exposé à ces rayons ultra-violets filtrés, aucune fluorescence.
La solution hydroalcoolique acide d’une teinte orangée jaune à la lumière du jour donne une fluorescence laiteuse légèrement verdâtre.
La solution éthérée acide est fluorescente avec une légère teinte verdâtre.
La solution éthérée même du pigment ne présente aucune fluorescence.
Il est bien entendu qu’au cours de ces expériences tous les solvants ont été soumis au même examen et qu’ils n’ont présenté aucun phénomène de fluorescence.
Analyse ionométrique du pigment :
Lors de l’étude sur les caractères culturaux de nos champignons, nous avons constaté que l’apparition de la substance chromogène est en rapport direct avec la concentration en ions H du milieu : celle-ci est même le facteur primordial, qui joue dans l’apparition de la substance chromogène, tandis que la température n’agit que secondairement. Ceci est encore plus vrai pour le Crypiococcus radiatus que pour le Cryptococcus corallinus.
Afin de contrôler l’influence de la réaction sur le pigment même, nous avons effectué quelques dosages potentiométriques avec des solutions du pigment purifé, ajustées à différents pH. Nous avons ainsi préparé une échelle de tampons à l’aide du potentiomètre à l’électrode d’antimoine dont les pH étaient les suivants :
DPBIEDES SO Ma SON SAT GDS ENT MS, 8,80 —- 10,39.
La substance chromogène étant très peu soluble dans les solutions acides, nous avons dissous 0,02 gr. de matière colorante dans des traces d’alcool amylique; cette solution
a été ensuite mélangée avec les tampons acides. Nous avons ainsi pu constater que les pigments prenaient une teinte orangée jaune très vive dans les pH acides de 1,78 à 5,47.
D'autre part, la coloration de la solution du pigment vire au violet améthyste à partir du pH de 8,6; entre ces deux limites de 5,47 et 8,6 les solutions du or ont une teinte peu prononcée très légèrement jaunâtre. Il existe donc un espace très large de part et d’autre du point de neutralité, où on ne remarque aucun virage.
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