HISTORIQUE

JL. — LES TECHNIQUES.

ARON et KLEIN (1930) eurent le mérite de proposer la première technique de dosage de l'hormone thyréotrope. Toutes celles qui lui sont postérieures en dérivent plus ou moins directement, à l'exception de quelques-unes. Ces deux auteurs s “exprimaient ainsi : € Dans tous les cas, 15 cc. d'urine ont été injectés en trois jours à des Cobayes d'environ 200 grammes et l'autopsie a été pratiquée le quatrième jour. En vue de la conservation durable dans l'urine du principe actif et de la suppression de certaines causes d'erreur, il est recommandable de chauffer l’urine à 75-80°, puis de la filtrer et d'y ajouter une trace de thymol... Sous l'influence de l'injection d'urine normale, la thyroïde du jeune Cobaye subit une réaction caractéristique consistant en une élévation pondérale de 40 % environ et en des signes d'hyperactivité discrète localisée au centre de l'organe : hypertrophie de l’épithélium vésiculaire, apparition de vacuoles de résorption au pourtour de la colloïde... Cette évolution de la glande se montre plus ou moins accusée selon les cas, mais les limites dans lesquelles elle varie ne sont pas très larges et peuvent être déterminées avec une exactitude satisfaisante, surtout sur la base de l'examen histologique. » Et ARON concluait : « La méthode que je viens d'exposer, intégralement appliquée à des cas où un déséquilibre endocrinien, intéressant la préhypophyse, était suspecté, m'a apporté parfois des indications d'une grande netteté, soit dans le sens d'une réaction thyroïdienne à peu près nulle, soit dans celu:

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d’une réaction manifestement plus intense que de coutume... Sans doute, cette méthode, assez délicate, exige-t-elle une connaissance très précise des rmages fournies par la thyroïide normale et l’étude préalable de nombreux témoins. On ne saurait non plus attendre d'elle une précision absolue, étant donné la gamme des variations individuelles où l’âge, le sexe, la concentration de l'urine ainsi que certaines particularités physiologiques (puberté, ménopause) sont susceptibles d'intervenir et dont il faudrait préalablement établir la part. Il n’en reste pas moins avéré que dans les affections accompagnées d’une forte exagération ou d'une forte diminution de l’activité glandulaire de la préhypophyse, les résultats tirés de la réaction que je propose ne semblent pas dépourvus de valeur. »

Nous avons tenu à citer à peu près intégralement ces conclusions d’ARON. Elles montrent bien, en effet, la complexité du problème qui nous occupe. Elles mettent aussi l'accent sur la sensibilité relative de la méthode. Néanmoins, celle-ci a fait l'objet d'un assez grand nombre d'applications pratiques. D'abord de la part d'ARON et de ses collaborateurs, par la suite de DEL: CASTiLLO (1932), KrocH et OKKELS (1933), SMITH et Moore (1933), HEvyL et LAQUEUR (1934), JUNKMANN et SCHŒLLER (1934), de PRAT (1937), CoPe (1938), EMERSON et CuTTING (1938), SENDRAIL et TAMALET (1939), STÉVENIN (1941), GAYRAL et. DaurTy (1948). Ces différents auteurs ont utilisé la technique d'ARON, les uns sans y rien changer, les autres en modifiant la qualité des produits injectés. GUYENOT, PoNsE et DoTTRENS (1935), EMERSON et CUTTING (1938) injectent au Cobaye un extrait alcoolique d'urine, FELLINGER (1936) un précipité acétonique du sérum sanguin (sérum desséché et redissous dans l’eau distillée à un pH très peu différent de 6,0) .dans le but d'éliminer l'hormone thyroïdienne circulante.

Tous ces travaux ont abouti rapidement à la définition d'une unité biologique d’hormone thyréotrope. Cette unité fut établie d’après les modifications dans l'aspect histologique de la glande thyroïde, liquéfaction et raréfaction de la colloïde, aspect vacuolaire de cette colloïde, caractère

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irrégulier et tourmenté des vésicules, hyperplasie cellulaire, mitoses, hyperhémie. Voici les unités utilisées (1) :

— 100 unités ARON : quantité d'extrait qui, après 36 heures, produit chez le Cobaye de 200 grammes une augmentation pondérale de la thyroïde de 50 à 100 % et fait apparaître des signes d’hyperactivité excrétrice généralisée à tout le parenchyme, allant au centre de la glande jusqu à l'excrétion totale de la colloïide avec un épaississement de l'épithélium vésiculaire atteignant son maximum :

— L'unité JUNKMANN-SCHŒLLER : quantité d'extrait qui, injectée pendant trois jours successifs à deux Cobayes de 100 à 150 grammes, provoque le quatrième jour, chez un des deux animaux au moins, un début de prolifération épithéliale avec fonte colloïdale typique. Cette unité paraît valoir deux à trois unités ARON :

— L'unité HEYL-LAQUEUR est la moitié de la dose qui, injectée deux jours de suite dans le péritoine de jeunes Cobayes (150 à 200 grammes) fait apparaître et même dépasser chez les deux tiers des animaux traités un certain degré défini de développement de l’épithélium thyroidien et cela quarante-huit heures après la première injection. Cette unité est très voisine de la précédente ;

— L'unité RowLANDs-PARKES est la quantité d’hormone qui, en cinq jours, double le poids de la thyroïde d'un Cobaye de 200 grammes. Elle vaut 7 à 13 unités JUNKMANN- SCHŒLLER.

Les extraits pituitaires thyréotropes du commerce sont titrés en unités JUNKMANN-SCHŒLLER ou HEYL-LAQUEUR.

RAwsON et STARR ont repris, en 1938, la technique de ARON en cherchant à lui donner une précision et une sensibilité plus grandes. Ils ont ainsi proposé les premiers

(1) Divers auteurs ont proposé d'autres bases de dosage de la TSH. I s’agit’ en l'occurrence, de tests indirects rejetés énergiquement var Lequeur et non considérés comme valables depuis lors. Ils avaient amené à la définition de deux types d'unités, l'unité Collip (taux minimum de TSH administré en deux injections qui augmente de 20 % le M. B. de Rats hypophysectomisés depuis quatre jours, et l'unité Cuyler, Stimmel et Mc Cullagh (quantité de TSH qui diminue de mecitié l’iodémie habituelle).

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l’utilisation de la méthode microhistométrique qui consiste à mesurer au moyen d'un dispositif spécial (micromètre oculaire) la hauteur d’une ou plusieurs cellules épithéliales. L'animal-test est toujours le Cobaye femelle immature, pesant entre 180 et 225 grammes. On injecte l'urine après l'avoir traitée par l’acétone, pendant trois jours consécutifs. Les thyroïdes sont enlevées le quatrième jour et fixées dans le formol neutre à 10 %. L'examen des coupes se fait à l'immersion : on étudie deux cents vésicules et, dans chacune d'elles, « une cellule représentative est choisie et sa hauteur déterminée au moyen d'un micromètre oculaire ». On fait ensuite la moyenne des chiffres obtenus. De toute évidence, la nécessité s'impose de tester concurremment un nombre important d'animaux témoins. On arriverait ainsi à doser la TSH jusqu'à 0,125 unité JUNKMANN et SCHŒLLER.

Dans le même but que RAWSON et sta DE ROBERTIS et DEL CoNTE exposent, en 1944, une méthode qui permettrait de déceler la TSH à des taux beaucoup plus faibles que précédemment. On atteindrait l'infime dose de 0,0002 unité JUNKMANN-SCHŒLLER. On prélève le sang que l'on traite ici encore par l’acétone. Le sang hémolysé ainsi traité est injecté dans les cavités cardiaques de Cobayes pesant 150 à 300 grammes. On sacrifie les animaux trente minutes après l'injection. Les thyroïdes sont congelées dans l'isopentane à — 195° C. ou dans l'air liquide, puis desséchées dans le vide à — 30° dans l'appareil de GERSH, traitées à l'alcool absolu pour dénaturer les protéines et incluses à la celloidine. On soumet les coupes à la coloration par le bleu d’aniline et l'orange G. Le nombre des gouttelettes dans les follicules de la zone interne de la glande est compté et le chiffre total divisé par la somme du diamètre moyen des follicules. Le quotient multiplié par 100 représente le nombre de gouttelettes contenues dans un follicule hypothétique de 100 » de diamètre. C’est le coefficient cytologique :

nombre de gouttelettes X 100

somme des diamètres moyens des follicules.

Au dire des auteurs, qui avancent d'ailleurs seulement trois dosages chez des sujets normaux, « les résultats ainsi obtenus concordent avec l’histoire clinique et les autres données de laboratoire ». C'est seulement en traitant le sang par la méthode de FELLINGER qu'il est possible d'arriver à des dosages aussi précis de quantités aussi minimes. L'injection de sang total ou de plasma ne produit pas de gouttelette colloïdale intracellulaire. Il est intéressant de constater que le Rat normal répond nettement à l’administration de 0,01 unité JUNKMANN-SCHŒLLER et que le Rat hypophysectomisé est complètement insensible à cette même dose (GRASSO). Aussi ne fûmes-nous guère surpris de voir Dvosxin (1947) conclure, après des études poussées, à l'absence absolue de caractère spécifique des gouttelettes colloïdales intracellulaires comme témoins de la stimulation par l'hormone thyréotrope.

Il nous faut mentionner maintenant la technique de BASTENIE (1940) basée sur les travaux de DUSTIN et ses élèves sur les poisons caryoclasiques. On injecte à des Cobayes de 200 à 250 grammes 2 cc. d'urine concentrée au dixième et traitée à l’éther, pendant trois jours consécutifs ; le quatrième jour, neuf heures et demie après une injection sous-cutanée de colchicine (25 gammas par 30 grammes de poids) l'animal est sacrifié. Les coupes sont colorées au trichromique de MASsSON ; un index mitotique dépassant quatre mitoses pour cent vésicules et amas cellulaires compacts ou une par champ microscopique (Zeiss 40 X L correspond à une réaction positive.

GUTHERT, à à peu près à la même époque, proposa une technique très voisine de celle de BASTENIE.

On a donc largement utilisé le Cobaye dans le but de doser l’hormone thyréotrope. Mais dès 1932, DEL CASTILLO ‘s'élevait contre l'emploi de cet animal, la zone centrale de ses thyroïdes présentant normalement des signes d'activité excrétrice. Cette critique, COLLARD la formulait non moins explicitement en 1940 : « Avec le Cobaye, le diagnostic d'activation thyroïdienne est ouvert à l'erreur, à cause de la zone centrale normalement hyperactive. » Aussi un cer-

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tain nombre d'auteurs ont-ils cherché à mettre au repos ces thyroïdes avant d'utiliser l'animal pour le dosage.

En 1936, DE FRÉMERY, se basant sur le fait que l’iode ou la diiodotyrosine amène l’involution histologique et fonctionnelle de la thyroïde, propose de se servir du Cobaye après préparation par la duodotyrosine. Malheureusement ELMER (1933) avait antérieurement montré que l'adjonction de diiodotyrosine à l'hormone thyréotrope inhibe l’action de cette dernière. Plus récemment, PURVES et GRIESBACH (1943 et 1949) ont administré au Cobaye une substance thyroïdienne mise en solution par digestion peptique selon la méthode décrite par eux (1943). Ces Cobayes sont âgés de 5 à 7 jours et subissent pendant neuf jours une mjection quotidienne équivalente à ]0 gammas d'iode. Le sérum à tester est administré à la dose de 2,5 ml. pour 100 grammes de poids d'animal pendant quatre jours consécutifs. La réponse à l'hormone est évaluée d'après les modifications de la hauteur cellulaire, mesurée par la méthode microhistométrique.

STEPHENS { 1940) a préconisé l'emploi du Cobaye après l’avoir soumis à deux ou trois semaines de jeûne, car « les changements morphologiques de la thyroïde sous l'influence du jeûne sont absolument semblables à ceux qui suivent l'hypophysectomie... et on connaît l'absence de réponse à l'iodure de potassium chez l'animal à jeun. »

La plupart des auteurs ont préféré abandonner le Cobaye et ont porté leur choix sur les animaux les plus variés. Certains méritent à peine d'être mentionnés. Ils sont, en effet, passibles des critiques que nous formulerons plus loin et, d'autre part, ils nécessitent un ensemble de conditions matérielles souvent difficiles à réaliser. Nous voulons parler des essais faits sur la Couleuvre par Mason (1938), le Poulet par JoNES (1939), le Pigeon par BATES, RIDDLE et LAHR (1941), le Poisson rouge par GorBMAN (1941). Signalons aussi pour mémoire les travaux de HELwIG (1933) et de Greposz (1934) sur le Lapin. Ils n’ont pu être poursuivis, la glande thyroïde du Lapin étant beaucoup plus active que celle du Cobaye.

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Le Poussin a fait l'objet de recherches plus approfondies qui ont abouti à la naissance de nouvelles unités d'activité thyréotrope. SMELSER (1937) eut le premier l'idée d'utiliser ces animaux qui paraissent beaucoup plus sensibles que le Cobaye à l'hormone thyréotrope. CoPe (1938), KaBac et LiapiN (1938), BERGMANN et TUuRNER (1939), CoLLarn, Mizcs, RUNDLE et SHARPLEY-SCHAFFER (1940), RawsoN et SALTER (1940), Dvoskin (1947) ont poursuivi les recherches de SMELSER, en modifiant plus ou moins la technique primitive de cet auteur. L'âge des Poussins va de un à vingt et un Jours. CoPE, KABAC et LIAPIN, BERGMANN et TURNER, COLLARD et ses collaborateurs, appliquent simplement le test d'ARON au Poussin. Les unités proposées furent les suivantes :

— Unité KaBAC-LIAPIN : taux de TSH amenant une augmentation de poids des thyroïdes de Poussin de cinq à six Jours de 8 milligrammes, après une série d’injections de cinq jours.

— Unité BERGMANN-TURNER : unité-Poussin mâle : taux total d'hormone administré pendant quatre jours qui peut augmenter de 50 % le poids moyen de la thyroïde de vingt Poussins pesant en moyenne 55 grammes ;

— Unité-Poussin femelle : taux qui, dans les mêmes conditions, augmente le poids moyen de la thyroïde de 20 % ;

— Unité ApAMS-BEEMAN : quantité capable d'augmenter de 100 9 la hauteur de |’ épithélium de la thyroïde de cinq à dix Poussins vingt-quatre heures après une injection unique sous-cutanée.

RawsoON et SALTER appliquèrent, en 1940, leur méthode microhistométrique décrite antérieurement à propos du Cobaye. En 1947 enfin, DvoskiN chercha à déceler par la méthode de DE RoBERTIS des doses infimes d’hormone thyréotrope ; JUNQUEIRA, quelque temps auparavant, avait eu les plus grandes difficultés pour utiliser cette même technique.

Pour terminer cette rapide étude des techniques, nous dirons quelques mots des travaux de D'ANGELO, GORDON et CHariPPer. Ces auteurs, frappés par la très relative

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sensibilité du Poussin et du Cobaye à l'hormone thyréotrope, ont jeté leur dévolu sur le Têtard. Leurs recherches les ont conduits à définir une nouvelle unité d'activité thyréotrope. C'est le taux minimum d’hormone qui, administré à l'animal non métamorphosé totalement, à jeun, en cinq injections intrapéritonéales à jour passé, peut stimuler la thyroïde, augmenter la longueur de la patte de derrière et entrainer une perte de poids de 50 % plus forte que celle des témoins injectés avec de l’eau. Ce test nécessite chaque fois quinze larves de Rana Pipiens. Il serait ainsi possible de détecter le soixantième et même le cent-vingtième du taux habituellement décelé chez le Cobaye.

Il est temps de jeter un coup d'œil d'ensemble sur tous les travaux que nous venons de mentionner. Plusieurs constatations s'en dégagent assez facilement.

Le poids des animaux varie considérablement d'une expérimentation à l'autre. En ce qui concerne le Cobaye par exemple, le poids oscille entre 100 et 300 grammes ; certains auteurs américains ont même eu recours à des animaux de 800 grammes.

Les produits injectés sont très différents les uns des autres : urine non traitée, urine lavée à l’éther, extrait alcoolique d'urine, extrait acétonique d'urine, urine employée après chauffage, sang total, sérum, sang hémolysé et traité par l’acétone. Notons, à propos de la méthode de FELLINGER, qu'elle extrait du sang non seulement l’iode et l'hormone thyroïdienne, mais encore une quantité indéterminée d’hormone thyréotrope. Cet écueil est compensé en partie par la possibilité d'injecter des quantités importantes de sang sous une forme réduite.

Aucun animal, à l'état normal, ne peut être considéré comme possesseur d'une thyroïde au repos complet. Cela est vrai, non seulement pour le Lapin, mais même pour le Cobaye. La zone centrale de la thyroïde de ce dernier animal est nettement active. Cela n’a peut-être pas grosse importance quand on est en présence de fortes quantités d'hormone thyréotrope, mais cela enlève toute valeur à la réaction pour la détection de faibles doses.

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On pourrait, à la rigueur, ne pas tenir compte des observations que nous venons de faire. Nous sommes amené maintenant à formuler une critique essentielle. Tous ces travaux sont basés sur la réponse histologique d’une thyroïde d’un animal non hypophysectomisé. Cela explique une partie, une grande partie même, de la confusion qui règne dans le dosage biologique de l'hormone thyréotrope. On souhaiterait voir se multiplier des techniques, peut-être différentes dans certaines de leurs modalités, mais unies par une base commune : l’utilisation exclusive d'animaux pituitoprives. Sans cette indispensable précaution, on ne fera qu'accentuer les difficultés de compréhension d’un problème déjà suffisamment complexe par lui-même. Il saute aux yeux que l'animal dépourvu de sa pituitaire (pituitoprive) constitue l'idéal vers lequel nous devons tendre en attendant que la biochimie ou l’immunochimie nous permettent de disposer de techniques plus sensibles et plus mathématiques que les méthodes biologiques. On sait que ces dernières sont entachées de plusieurs difficultés d'interprétation. Encore faut-il réduire celles-ci à leur plus strict minimum. HERTZ et OASTLER, dès 1936, insistalent sur ce point et, en 1940, CoLLARD écrivait : «€ C’est l'animal hypophysectomisé qui, de façon idéale, devrait être utilisé pour tester les hormones pituitaires afin d'éviter les effets secondaires produits par le matériel injecté en fonction de la pituitaire possédée par l'animal. » Ainsi s'expliquent ces lignes que nous extrayons du tout récent article de DE ROBERTIS : ( Le Rat hypophysectomisé est complètement insensible à l'administration de 0,1 unité JUNKMANN-SCHŒLLER, alors que le Rat normal répond à de telles doses (GRASs0O). » De même JONES a trouvé le Poussin de un jour plus sensible que le Rat hypophysectomisé à l’injection d'extrait thyréotrope. Mentionnons enfin les recherches de H. SELYE. Le syndrome général de l'adaptation auquel son nom demeurera justement attaché est trop connu actuellement pour que nous insistions davantage. Rappelons simplement que la pituitaire tient une place prépondérante dans le système des réactions mises en jeu par l'organisme en réponse à une agression non spé-