CAS PARTICULIER DES ACTINOMYCOSES

En ce qui concerne l'isolement de ces organismes, nous avons eu l'occasion d'étudier à ce point de vue les différentes techniques permettant un isolement sûr par la culture. Cet isolement, nous l'avons étudié selon que le matériel pathologique était constitué par des prélèvements de débris osseux ou encore de crachats prélevés après une hémoptysie importante,

Dans le premier cas il nous a été possible d'obtenir au moyen des particules osseuses des cultures pures d'emblée. Il était donc intéressant de pousser nos investigations plus loin, de manière à essayer d'élaborer une technique rigoureuse permettant lisolement facile des Aciinomyces en partant d’exsudats ou de pus provenant d’une inféction mixte et souillé par des bactéries banales. Les crachats que nous avions à notre disposition se prétaient très favorablement à ces recherches.

ANTONIOLI a pu isoler un Actinomyces provenant de crachats sanguinolents ; 1l a obtenu le parasite à l’état de pureté, par de nombreux repiquages sur milieu de SaABourAuD maltosé. L’auire espèce d’Actinomyces que le même auteur a isolé par ponction aseptique de la glande sous-maxillaire n’a pas évolué sur le milieu de SABouRAUD maltosé et ANToNIOLIr a dû essayer plusieurs autres substrats ; finalement, c'est sur milieu de jus de pomme de terre alcalin qu'il put cultiver son parasite avec succès.

Nous savons depuis les recherches d’IsRAËL et de Harz- Bosrroœm que la culture primaire à partir du matériel pathologique sur milieu artificiel est très difficile à réaliser. BosTrœM a ainsi effectué dans 11 cas d’actinomycose bovine des machoires, 700 ensemencements et n’a pu obtenir que 12 cultures positives. Parmi ces 12 cultures 7 seulement donnaient un diagnostic positif pour l’actinomycose.

Taiuss et Porrrowa remarquent que pour 10 à 20 tubes ensemencés, souvent un seul donne des colonies. Sarrory et MEYER ont pu isoler dans deux cas d’actinomycose sans grains le parasite grâce à la technique de Cazmerre. Lors de l'étude de ces cas, ils ont constaté les faits suivants : «L’ensemencement du matériel sur les milieux utilisés habituellement en microbiologie et suivant la technique normale, nous donne des cultures constamment négatives. Nos tentatives de culture n'ont réussi que par l'emploi de la technique citée par CALMETTE pour l'isolement du bacille tuberculeux en culture directe, à partir des organes malades ; le matériel pathologique prélevé aseptiquement est broyé et étalé sur la paroi du tube de culture. Après un court séjour à l'étuve pour faire adhérer les tissus au verre, ces tubes sont remplis

d'un mélange à parties égales de sérum sanguin et de milieu liquide de Sasouraup maltosé glycériné. Nous avons alors obtenu, après 15 jours ou un mois de séjour à l’étuve à +37°, la formation de petites colonies réparties sur les parois du tube, ressemblant aux granulations miliaires de la tuberculose. L'examen microscopique montre des chainettes longues formées par des filaments fortement fragmentés, tout-à-fait comparables aux arthrospores des Actinomyces. Ces éléments se distinguent des chaînettes streptococciques par la taille plus élevée et la présence de ramifications. Sur ces milieux d'isolement, le parasite ne montre jamais un autre aspect, Par des repiquages successifs sur des milieux de SABouRAUD maltosé solide, on arrive à faire évoluer l'organisme vers la forme filamenteuse habituelle des Actinomyces. »

L’isolement à partir d’un prélèvement d'une infection mixte souillée par des Staphylocoques, Streptocoques, Sarcines, Bacillus mesentericus ou d’autres bâtonnets est encore plus compliqué, car la plupart de ces germes évoluent sur les substrats artiliciels d’une façon plus luxuriante que les Actinomyces, et la culture de ces derniers est alors envahie et inhibée par les bactéries associées.

Comme milieu de culture, nous avons constaté que les chercheurs emploient le bouillon ordinaire, le bouillon glycériné, le bouillon glycériné à l’extrait de viande, le bouillon à l'extrait de foie, le bouillon gélatiné, gélosé, le sérum coagulé, le milieu de pomme de terre. Souvent on opère en milieu liquide isolé de l’air par une couche d'huile de paraffine. En France, on utilise le plus souvent le milieu de SABouRAuD maltosé ou glucosé ou aussi la gélose de SAUTON. En Allemagne, la culture en boîtes de Perri sur un milieu gélosé au sang-pyrogallate a été expérimentée. Wozrr et ISRAËL ont, dans quelques cas, eu recours à l'ensemencement à l’intérieur de l’œuf de poule ou de pigeon.

Nous avons pu trouver dans la littérature un certain nombre d'essais ont été effectués pour faciliter la croissance des cultures d’Actinomyces à partir des prélèvements pathologiques et pour supprimer l’envahissement des milieux par des microorganismes de nature banale ou provenant d’une infection secondaire.

Ainsi Leroux a élaboré une technique pour accroître la vitalité des Actinomyces et empêcher la croissance des microorganismes secondaires. Il emploie la gélose glucosée de VEILLON additionnée de quelques gouttes «d'extrait globulaire ».

La solution de lessive de soude ou de potasse employée avec succès pour l'isolement des parasites des teignes a été expérimentée à cet effet, mais les Actinomyces sont trop sensibles visà-vis de ces réactifs qui empêchent toute croissance.

G. SEIFERT a Cru résoudre le problème par l'emploi d’antiformine, mais toutes les recherches ont prouvé que les Aclinomyces sont incapables de résister contre l’action antiseptique de ce produit. Ces expériences ont surtout été menées par

Knorr (107). HELTZER (108) sur le travail duquel il nous faudra revenir, à donné la technique suivante : il mélange une partie du prélèvement (crachat) avec 2 parties de glycérine en agitant fortement. Puis il laisse reposer le mélange pendant 24 heures à l’étuve à +37° et il ensemence sur milieu gélosé.

Triuss et Porrrowa ont contrôlé cette méthode qu'ils ont modifiée légèrement ; ils ont obtenu des résultats très satisfaisants. Après le séjour à l’étuve pendant 24 heures du mélange exsudat-glycérine, ils ensemencent sur bouillon de viande peptoné gélosé en boîte de PErRI pour obtenir des cultures en plaques.

Dorp (109) a pensé que l'addition d’urée au milieu nutritif pourrait faciliter la poussée des Actinomyces. FELLINGER (110) à essayé d'obtenir l'isolement des Actinomyces dans les prélèvements des infections mixtes au moyen de l'acide sulfurique ; cette méthode est adaptée à la technique de LOŒwENSTEIN et SUMIYOSKI pour l'isolement du Bacille tuberculeux.

L'acide sulfurique a été employé pour la première fois pour tuer la flore bactérienne de pus tuberculeux souillé, par Bossar et Panpy en 1922. Mais la technique a été réellement expérimentée et justifiée par les recherches en série de LOWENSTEIN et SuMIxosxi, Ces auteurs emploient de l'acide sulfurique à 15 7 que l'on mélange à parties égales avec le pus à examiner, puis on lave le résidu à deux reprises au moyen de sérum physiologique. Hon a modifié légèrement la technique en ne favant qu'une fois au moyen de sérum physiologique ou même en supprimant complètement ce lavage.

Knorr a recommandé cette méthode pour isoler les Aclinomyces du matériel pathologique en employant de l'acide sulfurique à densité — 1060.

Nous avons, au cours de nos travaux, eu l’occasion d’effectuer des recherches au moyen de différentes souches et espèces d’Actinomyces, afin d'examiner le pouvoir d’acido-résistance visà-vis des différentes concentrations en acide sulfurique. Nos expériences ont été pratiquées au moyen d’émulsions de cultures d’Actinomyces dans du sérum physiologique. Les différentes espèces employées provenaient de la mycothèque Sarroryx et renfermaient soit des organismes repiqués depuis quelques années par réensemencements successifs, donc très probablement dépourvus de toute virulence ou doués d’un pouvoir pathologique très faible, soit de parasites récemment isolés de lésions humaines.

Toutes les souches soumises à l'épreuve ont supporté le traitement au moyen d'acide sulfurique à 5 Ÿ ; sans aucun retard de croissance. Les Actinomyces virulents ou récemment isolés ont sans dommages résisté à l’action de l'acide sulfurique à 10 %. Dans l’ensemble, nous avons pu constater que tous les organismes utilisés peuvent facilement supporter un traitement au moyen d'acide sulfurique à 7 %.

Nous voyons donc que si les Actinomyces en suspension aqueuse ont un pouvoir acido-résistant allant jusqu'à 10 7, les

champignons parasiles se trouvant dans les pus ou les prélèvements pathologiques, contenant toujours une forte concentration de matières protidiques, de fibrine et de tissus conjonctif, doivent sûrement supporter facilement des doses d’acide sulfurique plus fortes, car la protection par les éléments cytologiques du pus s'y manifeste plus énergiquement qu’en solution saline seule.

Notre technique pour l’étude du matériel pathologique à été établie de la façon suivante : On ensemence d’abord un tube de bouillon gélosé et un tube de sérum de cheval coagulé pour déterminer après 24 heures la flore de l'infection mixte et des saprophytes. En effet, les bactéries des groupes : Sarcine, Bacillus subtilis, Staphylocoques exigent des concentrations en acide sulfurique plus élevées, pour empêcher leur croissance, que celles des groupes : Streptocoques, Pneumocoques, Pseudodiphtériques.

Après avoir déterminé ces agents de l'infection mixte, nous employons de l'acide sulfurique, soit à 87, soit à 157 ; nous mélangeons avec toutes les précautions d’asepsie, à parties égales, le prélèvement mycosique avec l'acide sulfurique et nous laissons en contact à 37° pendant b minutes. De cette façon, nous diluons l’acide sulfurique de moitié et nous avons par exemple pour le cas de l'infection mixte à Staphylocoques une concentration à 7,5% en acide sulfurique ; pour le cas d’une infection mixte à Streptocoques une concentration à 4%.

Après ce temps de séjour à l’étuve, nous centrifugeons le tout pendant 5 minutes. Nous décantons le liquide surnageant et nous lavons le culot à deux reprises à l’aide d’une solution physiologique à 0,77 et nous diluons avec la même solution saline une troisième fois. Nous ajustons, s'il est nécessaire, le pH à 7,2 au moyen d’une solution stérile de soude N/r00 et nous ensemençons nos différents milieux ci-dessus mentionnés au moyen de cette émulsion.

Il est important de faire ces opérations au moyen de la totalité du pus ou du prélèvement osseux et de ne pas sélectionner des grains ou d’autres éléments suspects pour les soumettre séparément à l’action de l'acide sulfurique.

En ce qui concerne l’ensemencement des milieux, il faut suivre les règles que nous avons indiquées pour les Blastomycètes et utiliser des milieux à base de maltose.

Quelques auteurs tels que Dosrar (111) et FELLINGER recommandent l'addition de Saponine MErCk (1 à 27) aux milieux maltosés qui doit favoriser la croissance des Actinomyces. Ce dernier auteur a même élaboré un milieu à l'œuf d’après les principes de LOEWENSTEIN pour le bacille de Kocu. Mais nous croyons qu'il n’est pas nécessaire, pour la pratique courante, d'employer des substrats de composition et de préparation très minutieuses, car les milieux de SasouraUp liquides ou solides, modifiés suivant nos indications précédentes, nous ont toujours donné entière satisfaction.

Nous récapitulons donc :

a) Ensemencement d’un milieu gélosé au bouillon et d’un

milieu de sérum de cheval coagulé ;

b) Préparation d’un mélange d’une partie de prélèvement et

d’une partie d'acide sulfurique à 8 ou 15% ;

c) Placer à l’étuve à 37° pendant 5 minutes ;

d) Centrifuger pendant 5 minutes ;

e) Fumer et laver deux fois avec du sérum physiologique

does

f) Diluer le résidu avec un peu de sérum physiologique et

amener au pH=7,2 à l’aide de Soude N/100 ;

g) Ensemencer les milieux maltosés liquides et solides au

moyen de l’émulsion saline.

Deux séries de milieux sont nécessaires, l’une pour la culture en aérobie à +37°, l’autre pour la culture en anaérobie à +37°. Nous avons employé avec beaucoup de satisfaction un petit appareil pour la culture en anaérobie, que nous nous permettons de décrire succinctement ici. Il a d’ailleurs été imaginé par TRAUT- WEIN (112) et peut être facilement construit pour une somme modique. Le principe de cette méthode est celui d'EMMERLING qui a recours au pyrogallate de potasse avec toutefois la modification donnée par ZEISSLER par l'emploi d’un vide relativement faible au début.

On emploie un verre de conserves d'environ 24 em de hauteur et 14 cm. de diamètre ; on y introduit un petit panier en fil de fer employé couramment dans les laboratoires de bactériologie qui sert de support aux boîtes de PETRI ou aux tubes de culture, À ce panier, on fixe une petite vénule ouverte de 30 cc dans laquelle on a disposé 15 cc de lessive de potasse. La vénule est munie de son bouchon dépourvu au préalable du tube coudé servant habituellement de soupape et de support de l'aiguille. A la place de celui-ci, on fixe un autre tube en forme d’U dont une branche plonge profondément dans la lessive de potasse et l’autre branche reste libre à l’extérieur de la vénule. Le bout de cette branche a été effilé par étirement au-dessus du bec BUNSEN.

On fixe en outre sur le panier-support un petit manomètre en forme d'U également de 30 mm de hauteur. Ce tube fermé d’un côté est rempli de mercure jusqu’à demi-hauteur. La graduation se fait arbitrairement sur une feuille de papier placée au niveau du tube manomètre.

Dans le fond et au milieu du verre à conserves, on place un petit verre de montre à plan convexe dans lequel on met de l’acide pyrogallique. Le panier contenant les tubes de culture ensemencés est disposé alors dans le verre à conserves, On place deux anneaux de caoutchouc sur le bord ouvert du vase et on ferme le tout au moyen du couvercle. Puis on aspire par l'intermédiaire d’un embout effilé adapté à la trompe à eau, l'air contenu dans le vase en appuyant légèrement avec la main sur le couvercle. On fait ainsi un vide relatif qu’on peut contrôler à l’aide du manomètre. Si la pression à l’intérieur du dispositif est devenue stable, on retire d’un coup sec l’embout disposé entre

les deux anneaux de caoutchouc et le vide se maintient à l'intérieur. La lessive de potasse commence à monter dans le tube en U et bientôt des gouttelettes s’écoulent par le bout effilé dans le fond du vase. Si on incline alors le récipient légèrement à droite et à gauche, la lessive de potasse vient au contact de l'acide pyrogallique et il se forme du pyrogallate de potassium. L'oxygène restant dans le récipient est ainsi absorbé, ce que l’on peut facilement contrôler par une nouvelle montée du manomètre.

Nous avons toujours introduit dans notre appareil un tube ouvert rempli d’eau distillée ; celui-ci empêche la dessication des milieux de culture ; on peut aussi placer l'appareil renfermant les cultures dans l’étuve à + 37° ct suivre facilement et la constance du vide et la croissance des cultures.

Ce petit appareil très facile à réaliser peut rendre de grands services pour l'isolement des Actinomyces anaérobies provenant de prélèvements osseux.

Nous croyons ainsi avoir exposé l’ensemble des techniques de cultures pour l'isolement des champignons inférieurs à partir de pus ou d’autres prélèvements pathologiques.