MILIEUX DE CULTURE

Cette étude est forcément très complexe et quelques travaux se sont déjà atlaqués à ce sujet. Les très belles et intéressantes recherches de M. Gessard (1) ont jeté une grande lumière sur cette question si ardue.

(4) Ann, de l'Institut Pasteur, Tome V, 1891, p. 737,

Pour en simplifier l'étude, nous ne prendrons aucun milieu de culture naturel, lait, bouillon de bœuf, pomme de terre, etc. Car l'analyse des phénomènes y est trop difficile à suivre ou souvent même impossible.

Tous nos efforts ont tendu à obtenir un bouillon synthétique de composition aussi simple que possible et produisant à coup sûr le pigment bleu.

Les ensemencements sont faits dans des milieux de culture qui, après stérilisation, sont toujours neutres ou mieux très légèrement acides à la phénol-phtaléïne ; car nous avons constaté que cette condition était nécessaire pour obtenir une belle production de pigment.

Le Bacillus Syncyanus exige, pour vivre et produire la matière colorante bleue dans un milieu synthétique, une source d'azote, de carbone et un sel minéral.

Nous allons maintenant rechercher sous quelle forme il faut offrir ces éléments à la bactérie pour obtenir les meilleurs résultats.

Influence de l’Azote

Peptone, — Dans un bouillon à 3 % de glucose massé ordinaire et 0,2 % de peptone sèche, le Bacillus Syncyanus se. développe très bien, mais sans produire ni pigment bleu ni fluorescence.

Nous laisserons donc la peptone de côté, puisque ce corps ne donne pas la matière colorante que nous désirons obtenir. Nous avons constaté avec ce corps la formation d'ammoniaque.

Albumine. — Une solution à 3 % de glucose ordinaire et 0,8 % d'albumine sèche, puis filtrée sous pression sur une bougie Chamberland, ne nous a donné que de mauvais résultats.

Tout d'abord, il ne se produit aucune formation de pigment bleu. De plus, le Bacillus Syncyanus vit mal dans ce milieu. Il y végète et se développe peu. Enfin, après plusieurs générations, en général 4 à 5, la bactérie, réensemencée dans un milieu favorable à la production de son

pigment, reprend vigueur et se développe normalement, mais sans secréter de matière colorante. Il nous a été rarement possible, dans la suite, d'arriver à lui rendre son pouvoir chromogène.

Urée, — Ce corps, pas plus que les précédents, ne nous a donné de bons résultats pour la formation du pigment. Dans une solution à

3 % de glucose ordinaire, 0,5%CO(NH) et 0,4%S0,Mg,

le Bacillus Syncyanus se développe médiocrement, mais sans produire de matière colorante.

Asparagine, — Un des premiers bouillons, que nous avons utilisé avec quelques succès, était composé de 3 % de glucose ordinaire et 0,5 d'asparagine. Nous avons été amenés par la suite, comme nous le verrons plus loin, à ajouter à ce milieu 0,4 % de SO,Mg.

Dans ce bouillon, le Bacillus Syncyanus se développe admirablement. Vers le cinquième jour, il se forme un anneau bleu superficiel qui court le long des parois.

Les jours suivants, la coloration s'étend à toute la partie supérieure du liquide avec formation en surface de points brillants d'un éclat mordoré. Puis le bleu tourne au gris-vert, au gris-ardoise et enfin précipite vers le dixième jour.

Nous avons constaté dans ces milieux une augmentation d'acidité pendant les six premiers jours. Cette acidité reste ensuite à peu près stationnaire, pour décroître enfin très légèrement vers le neuvième jour. Nous étudierons du reste * plus en détails ce phénomène dans un milieu approprié.

La végétation bactérienne produit dans ce milieu une formation notable d'ammoniaque.

Bien que de composition assez simple, donnant un bon développement des bactéries et une formation convenable de pigment bleu, nous avons dû abandonner le milieu glucose asparagine-S0,Mg pour différentes raisons.

Tout d'abord, il est impossible de doser de manière exacte l'Azote ammoniacal qui se forme en présence de

CO, — CHNH, — CH, — CONH,

Car, même dans le vide à 350, distillée avec MgO, une solution d'asparagine se dissocie et laisse passer des quantités très variables de NH.

Enfin, dans ce bouillon, qui nous avait donné d'excellents résultats au début, après quelques mois de culture, le Bacillus Syncyanus ne produisait plus qu'un pigment bleu sale et même a cessé totalement de nous donner de la matière colorante sans que nous eussions modifié en quoi que ce soit la composition du milieu,

Sels ammoniacaux

D'après les travaux antérieurs, deux acides organiques, l'acide succinique et l'acide lactique avaient donné de bons résultats, tant pour le développement du Bacillus Syncyanus que pour la production de son pigment.

I nous a paru intéressant de rechercher si d’autres acides bibasiques ou acides-alcools pourraient jouer le même rôle que

COOH — CH; — CH; COOH et CH; — CHOH — COOH.

Mais aucun de nos essais ne nous a donné de résultats satisfaisants. Jamais nous n'avons pu obtenir la formation du pigment bleu, et même quelquefois — avec l'oxalate d'am moniaque entre autres — le Bacillus Syncyanus se développait mal.

Nous avions espéré surtout obtenir des résultats intéressants avec l’Acide tartrique

CO,H — CHOH — CHOH — CO,H, à cause de sa parenté avec l'Acide succinique, CO,H — CH — CH> — CO,H.

Mais les deux groupements hydroxyles ne favorisent pas la formation de la matière colorante. Et cependant avec l'acide lactique, qui est également un acide alcool,

CH; — CHOH — COH, vn obtient le phénomène de pigmentation. Toutefois, la bac-

Lot

térie se développe convenabiement dans un milieu au tartrate d'ammoniaque.

Nous n'avons été guère plus heureux avec un bouillon au Citrate d’ammoniaque. C'est à peine si l'on obtient une vague teinte verdâtre.

Parmi les sels ammoniacaux minéraux, PO;HAm, nous à donné d'assez bons résultats, bien que le bouillon ait été basique à l'origine. Nous verrons d'ailleurs, plus loin, qu'une certaine basicité n’est pas un obstacle absolu à la formation du pigment coloré. Trois jours après l'ensemencement de ces bouillons contenant : glucose pur 2 %, PO;HAm 0,50 % et SO,Mg 0,4 %, il se produit une coloration assez intense vert feuille morte,qui passe rapidement au brun en 48 heures environ.

Le PO;,HAm donne de meilleurs résultats, précisément à cause de son acidité. On n'obtient pas cependant une matière colorante d'un bleu aussi net qu'avec le lactate et surtout le succinate d'ammoniaque.

Une culture, provenant d'un bouillon au PO;HAm, et réensemencée dans un milieu à 3 % glucose pur, asparagine 0,5 % et SO,Mg 0.5 % nous a produit, une fois, un Curieux phénomène de fluorescence. Cette culture, qui était très légerement acide au début (l'acidité de 100 em correspondait à 9 cm de NaOH n/20 à la phénol-phtaléïine) était devenue très nettement basique. Il fallait 28 cm° de SO,H, n/40 pour faire disparaître la fluorescence de 100 cm* de ce bouillon et près de 40 em* de SO,H, n/40 pour faire virer la phénol-phtaléine. Cependant, sept autres flacons témoins, de glucoseasparagine, ensemencés le même jour avec la même culture, donnaient une production normale de pigment bleu et un accroissement d'acidité.

Nous avons alors réensemencé cette cullure fluorescente dans des bouillons glucose-asparagine, de composition exactement semblable ; mais les uns étaient rendus légèrement acides, d’autres étaient exactement neutres à la phtaléïne, et les troisièmes légèrement basiques. Le Bacillus Syncyanus s'est parfaitement développé dans ces trois milieux, mais

le phénomène de fluorescence n'a pas réapparu, pas plus d'ailleurs que la formation du pigment bleu. Des cultures successives, dans toutes sortes de milieux favorables, n'ont pu rendre à la bactérie ni son pouvoir chromogène, ni son pouvoir fluorescent.

Au microscope, nous n'avons remarqué aucune modifica tion morphologique de la bactérie.

Nous avons essayé ensuite, en repartant d’une culture normale du PO;HAm;, de reproduire ce phénomène de fluorescence par réensemencement dans un bouillon de glucoseasparagine, de même composition que celui qui nous avait donné ce curieux résultat et tous nos essais ont toujours échoué. Dans la suite, nos diverses cultures, pour l'obtention du pigment bleu, ne nous ont jamais plus reproduit ce phénomène. [l était probablement causé par une symbiose, due à une infection accidentelle.

Les autres acides minéraux ne donnent que de mauvais résultats et même nuisent presque toujours à la vie de la bactérie.

Cependant, il est possible d'employer dans une culture

le SO,Am,, mais à la condition qu'on fournisse au Bacillus

Syncyanus l'acide succinique sous une autre forme. Comme nous le verrons un peu plus loin, S0,Mg est nécessaire à la bonne formation du pigment. Nous avons essayé de remplacer CO,Am — CH; — CH; — CO,Am et SO,Mg par CO9 — CH — CH; — CO et SO,Am.

M he.

Nous avons alors obtenu une formation bien plus sûre du pigment et surtout ce pigment était plus abondant et d'un bleu bien plus net et intense qu'auparavant.

Ïl était intéressant de constater que le Bacillus Syncyanus utilisait aussi bien l'acide sulfurique et l'acide succinique, qu'ils soient combinés à l'ammoniaque ou à la magnésie, pourvu que ces deux bases soient présentes.

Le succinate de chaux ne donne pas un aussi bon résullat, loin de là. De plus, il a l'inconvénient de former à la

stérilisation un succinate basique peu soluble. Une grande partie de l'acide succinique se trouve donc ainsi inutilisable.

Nous avons aussi essayé de fournir N sous la forme de la matière colorante produite par le Bacillus Pyocyaneus, la pyocyanine.

Nous avons obtenu et extrait la pyocyanine comme l'a indiqué M. Gessard (1). Nous l'avons ensuile combinée à l'acide sulfurique et ainsi obtenu une solution d'une superbe matière colorante rouge, mais malheureusement en trop faible quantité. Aussi, nos expériences ont-elles manqué suffisamment de précision pour pouvoir en tirer une conclusion. De plus, ce sel de pyocyanine était souillé de traces de SO,Am,, malgré plusieurs purifications. Nous ne serions parvenus à nous en débarrasser complètement qu'en perdant presque la totalité de cette précieuse base.

Influence des hydrates de carbone

Comme M. Gessard (2) l’a déjà observé dans les milieux synthétiques, la présence de Glucos2 est nécessaire à la production du pigment bleu. D'après cet auteur. cet hvdrate de carbone fournit une augmentation d'acidité nécessaire et remplace ainsi le phénomène de symbiose, la fermentation lactique, que l’on constate toujours dans le lait lorsqu on y observe la formation d'une coloration bleue, due au développement du Bacillus Syncyanus.

Etait il possible de trouver un succédané au (rlucose ? C'est ce que nous n'avons pas manqué de rechercher. Dans

‘les bouillons qui nous avaient déjà servi, formés de 0,4 % SO, Am, et 0,5 % succinate de magnésie, nous avons rem. placé les 3 % de Glucose par différents sucres, en en cherchant le taux le plus favorable. Malheureusement, tous nos essais n'ont abouti qu'à des échecs.

(4) GESSARD. — De la pyocyanine et son microbe. — Thèse de Paris, 1882. (2) GESSARD. — Fonctions et races du bacille cvanogène (Ann. de l'Inst. Pasteur, 1891).

Nous avons tout d'abord employé le Lévulose, à cause de sa proche parenté avec le {rlucose. Nous avons obtenu un déve loppement normal de la bactérie, mais sans production de pigment. Le bouillon qui, au début, avait une acidité correspondant à 10 cm de Na OH n/20 pour {00 em, était devenu basique. Cette basicité était neutralisée à la phtaléine par S,S em° de H, SO, n/40 pour 100 em:

Avec le Xylose, le développement même de la bactérie était à peu près nul.

Le MHaltose ne nuit pas à la vie du Bacillus Syncyanus, mais, cependant, il n'est pas consommé. Nous avons pu constater, par des dosages de ce sucre, au début et huit jours après l'ensemencement, que le taux de ce corps n'avait diminué que d'une façon extrêmement faible.

L'acidité du milieu n'avait pas augmenté.

Nous avons également ensemencé le Bacillus Syncyanus dans une infusion de malt stérilisée et légèrement aciduléeæ La bactérie y végète normalement, mais sans produire de pigment.

Le Saccharose convient mal au développement du bacille. I ne produit aucune coloration et n'est pas inverti. Même par addition d'une trace de levure, on n'oblient pas de meilleurs résultats.

Nous avons également essayé un bouillon additionné de 5 em? % d'empois d'amidon. Dans un ballon, nous avons ensemencé directement le Bacillus Syncyanus, et, dans un autre, nous n'avons fait la culture qu'après avoir ajouté quelques centimètres cubes d'une infusion de malt. Dans l’un comme dans l’autre cas, les résultats obtenus ont été négatifs.

Influence des sels minéraux

La nécessité de la présence de sels de magnésium avait déjà été reconnue pour obtenir une belle formation de pigment coloré. |

Nous avons recherché quelle était la dose optima pour le

ENOTER

S0, Mg, en la faisant varier de 0,005 % à 5 %. Nous avons constaté qu'elle se trouvait entre 0,4 et 0,5 %.

Nous avons également fait ces essais pour le succinate de Mg, et avons trouvé qu’un bouillon, à 3 % de glucose ordinaire, 0,4 % SO, Am et 0,5 % suceinate de Mg, donnait les meilleurs résultats.

Il était intéressant d'essayer de remplacer le magnésium par le calcium. Mais le sulfate, et surtout le succinate de Ca, ont l'inconvénient de n'être pas assez solubles. Les résultats obtenus avec ces deux sels ont été très médiocres.

C'est ex changeant le glucose ordinaire que nous em- #ployions, et surtout en utilisant du glucose « chimiquement » pur, que nous avons reconnu la nécessité absolue de la pré-

sence de PO, H, pour obtenir une belle formation de matière colorante.

UE Les cendres de 100 grammes de notre premier glucose, r ii nous donnait de bons résultats, contenaient 0 gr. 63 de : (PO, } Cas, tandis que le second ne contenait que 0 gr. 10 de

(PO) Ca, et ne donnait qu'un vilain pigment peu abondant.

Avec le glucose pur, on n'obtenait plus trace de matière co-

lorante.

Nous avons reconnu qu'avec le glucose pur, il fallait ajouter 1 gramme de (PO,), Ca H, par litre de bouillon pour avoir des résultats satisfaisants. [ls étaient, cependant, loin d'être comparables à ceux obtenus avec le glucose ordinaire contenant du phosphore organique.

Le phosphate acide de chaux peut, à la rigueur, être remplacé par PO, H,K, mais il nous a semblé que le sel de chaux lui était préférable.

PO, H K, ne donne que de médiocres résultats, car il manque alors l'acidité initiale, nécessaire à la bonne production du pigment.

H CI, combiné à quelque base que ce soit, ne favorise pas la formation de matière colorante, et mème nuit, en général, au développement du Bacillus Syncyanus, excepté sous forme de Na Cl et Ca Cl.

Nous avons également essayé l'effet des sels de fer et

manganèse, au maximum et au minimum. Même à l'état de traces, ils nuisent à la production du pigment bleu.

Le bouillon de culture dont Fraenkel et Voges donnent Ja composition :

LEE AT CMAEENRPETEES Mr ) grammes 1H fe L'EUSAEENNRRSENERERAN 2 — LattatesdiAmr, : ::2, m0 6 = VENT 21" RETENIR PS LA — RARE EE AE: salt 1.000 —

convient admirablement au développement du Bacillus Syncyanus. Il se forme en surface un voile muqueux extrêmement épais et tout le liquide devient opalescent. Mais la production de pigment y est impossible. En ajoutant 3 % de glucose, il se produit une légère teinte bleutée qui augmente d'intensité en diminuant la dose de Na CI.