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NH, en milligrammes :

À heures | 48 heures | T3 heures ! & heures | Ftheume

Il est assez curieux de cConslaler, d'après ces résultats. que dans le premier cas, où il y à eu une production normale de matière colorante, le rapport entre le glucose disparu et l'augmentation d'acidité est à peu prés constant,

6,3 96,8 91,8 ee ES A TT D 7 0 10 — € 49,5 291 4 029 E:6 LE 60 “il Dans le deuxième cas, cette constance est déjà bien faible. 4,9 21,8 21,5 16,7 3,9 0,09; 0,18; 0,10: 2" —0 44. = 90 ne 52 OR D ip MS 0,06

Enfin, dans le troisième, où il n y à pas eu formation de matière colorante, cette constance n'existe pas.

LIEN ep 0,94 —= 0,61 = —0,37 = —0 6, TA + 112 ” 208 D

PRÉSENCE D'UNE OXYDASE

La sensibilité extrême que montre le Pacillus Syncyanus, pour la production de son pigment, à la moindre variation de la composition ou de l'état du milieu de culture et surtout à l'action de ja chaleur, nous a fait présumer que la formation de la matière colorante n'était pas simplement due à l'action directe de la bactérie sur les-éléments du bouillon, mais bien à une action secondaire, conséquente de la vie de la bactérie, à une action diastasique.

N est-il pas, en effet, à remarquer que si le Bacillus Syncyanus possédait par lui-même le pouvoir chromogèene, la production du pigment bleu serait parallèle à la vie de la bactérie ?

Or, ce n'est que 48 heures après l'ensemencement que commence à apparaître une légère teinte bleue, tandis que nous constatons au microscope qu'après 24 heures de cultures à 200, le développement bactérien est déjà assez intense.

Nous avons recherché, avec une solution alcoolique de

résine de Gaïae si, dans un échantillon de cultures commençant à bleuir, nous constations la réaction bleue, caractéristique des diastases, avec ou sans addition d'eau oxY£ génée. Nous n'avons jamais pu obtenir un résultat positif.

Nous avons alors essayé un réactif des Orydases indiqué par M. Grüsz (1) et signalé auparavant par Wurster. C'est une solution aqueuse, incolore, faite au moment de nous en servir, de chlorhydrate de tétraméthyl-paraphénylène-dia mine. Avec une goutte d'une culture commencant à bleuir, il se forme instantanément une magnifique coloration rougeviolacé caractéristique. Le Bacillus Syncyanus secrète donc bien une oxydase. (

Nous avons ensuite pu constater, au moyen de ce réactif, que 24 heures après l'ensemencement, alors que le bouillon ne présente qu'un développement bactérien médiocre et pas trace de pigment bleu:

10 Une culture qui produit déjà la réaction rouge-violace caractéristique donnera de la matière colorante ;

2 Une culture qui n'offre à aucun moment cette réaction ne donnera pas de matière colorante ;

30 Lorsque la réaction est instantanée et intense, on peut être assuré d'obtenir un beau pigment abondant et d'un bleu net. Au contraire, si la réaction est progressive et faible, on n'obtiendra qu'une faible quantité de pigment et une vague teinte gris-bleu ou vert sale.

Le phénomène de pigmentation est bien la conséquence directe de la production d'une Orydase.

Nous avons, en effet, vérifié ces faits sur tous les bouillons que nous avions utilisés jusqu'alors. Dans tous les milieux, quelle que soit leur composition, si l'on ne constate pas, le lendemain de l'ensemencement, la coloration rouge-violacé due à l'Orydase avec une solution fraiche de chlorhydrate de tétraméthyl-paraphénylène-diamine, on peut ètre certain de ne pas obtenir de matière colorante,

(4) Ueber die Abhængigkeit der Bildung transitorischer Stærke von der Temperatur und der oxydasichen Wirkung. GRuSz. — Wochenschrift für Brauerei, 1899, XVI, p. 549.

Il importe que la solution de ce sel soit toute fraiche, faite au moment de s'en servir, sinon elle se colore déjà sous l'action de l'air et la réaction perd de sa netteté.

Nous avons déjà vu l'action de la chaleur sur la formation de la matière colorante. Tout ce que nous avons observé à son sujet peut s'appliquer à l'Orydase.

C'est-à-dire que depuis la température où le Bacillus Syncyanus commence à se développer. jusque vers 270-280, il y à production d'Oxydase. Cette production passe par un maximum d'intensité entre 18° et 22, puis diminue et s'annule vers 300.

De plus, celte Oxydase est rapidement détruite par la chaleur. Ainsi prenons une culture de 24 heures, faite à l'étuve à 200, donnant une belle réaction oxydasique. Portons-la à 30°. En moins d'une heure, cette réaction aura considérablement diminué d'intensité et deviendra presque nulle au bout de quelques heures.

I suffit de 15 à 20 minutes à 35° pour l'annuler presque complètement.

Et elle ne résiste pas du tout à 400-450,

Nous avons essayé l'influence de l'Orydase produite par le Bacillus Syncyanus sur différents corps oxydables, entre autres l'hydroquinone. Mais, malheureusement, tous nos essais ont été négatifs.

Action de l’oxydase

Pour étudier de plus près l’action de l'Orydase sur le bouillon synthétique et la formation de la matière colorante bleue, nous avons pris une culture, qui, après 24 heures d'ensemencement, donnait une très belle réaction oxydasique, mais sans trace encore de matière colorante. Nous l'avons filtrée, sous une pression d'air comprimé, sur une bougie « Chamberland » et avons recueilli le filtrat dans un ballon stérilisé. Nous avons constaté qu'un échantillon du liquide filtré donnait encore très nettement la réaction oxydasique

mais d'une façon un peu moins intense qu'avant la filtration.

Nous avons ensuite remis ce bouillon filtré dans l'étuve à 200. Le lendemain, alors qu'une culture témoin non filtrée commençait à donner une belle coloration bleue, le bouillon d'épreuve n'avait pas changé comme on pouvait le supposer. Nous y avons vérilié la réaction oxydasique el avons constate qu'elle avait considérablement diminué et n'était plus que très faible. 36 heures après la filtration, elle n'existait plus.

Nous avons, quelques jours après, réensemencé ce bouillon filtré et resté incolore; il est admirablement reparti et a donné une très belle matière colorante bleue.

LL était ensuite intéressant de vérifier l'action de l'Uxydase sur une culture ne donnant pas de pigment coloré. Pour cela, nous avons préparé trois bouillons. L'un, selon notre formule, capable de fournir le phénomène de pigmentation ; les deux autres à : 3 % glucose pur, 0,5 % succinate de Meg et 0,4%S0,Ams. Ces deux derniers étant dépourvus de (PO;}CaH, ne devaient nous donner ni Oxydase ni matière colorante. Nous ensemençcons en même temps ces trois ballons. 24 heures après, nous constatons que le bouillon I donne une très belle réaction oxydasique ; les deux autres ne présentent à aucun degré ce phénomène.

Nous filtrons le bouillon 1 comme nous l’avions déjà pratiqué. Aprèsavoirrecueilli le filtrat dans les plusgrandes conditions d'aseptie et vérifié qu'il donnait encore la réaction oxydasique, mais sensiblement diminuée, nous avons ajouté au bouillon Il 25 cm° de ce bouillon 1, et au bouillon El un volume égal au volume de la culture.

Le lendemain, ni Il ni Il ne présentent de traces de pigmentation, tandis qu'une culture normale témoin commence à se colorer en bleu. De plus, Il ne donne pas de réaction oxydasique, mais III produit une coloration rouge violacé assez nette avec une solution du réactif. Cette réaction est plus franche que celle du bouillon EI après filtration.

Le surlendemain, Il présente un développement bactérien normal, mais sans production de pigment.

Le bouillon IT fournit, au contraire, une petite quantité

de matière colorante gris-bleuté qui augmentera un peu d'intensité, mais sans parvenir jamais à la coloration obtenue dans un bouillon normal.

Nous avons ensuite ajouté le bouillon oxydasique filtré à des cultures de différents âges, 2, 3, 4 et 5 jours.

Les résultats obtenus sont exactement les mêmes que précédemment, avec cette seule différence que plus la cullure est vieille plus la formation de matière colorante est faible.

Les expériences précédentes semblent démontrer qu'il ne suflit pas d'ajouter à une culture où se developpe bien le Bacillus Syncyanus, mais sans produire de matière colorante, une certaine quantité de bouillon filtré contenant de l'Oxydase pour obtenir la production du pigment bieu. Si cette addition suffisait, il est évident que, vingt-quatre heures apres celte opération, on devrait constater l'apparition d'une coloration en même temps que se produit le phénomène de pigmentation dans une culture normale témoin. Or, il n'en est rien.

De plus, nous avons constaté que dans la culture, où nous n'avons ajouté que 25 cm’ de bouillon oxydasique filtré, la réaction oxydasique disparaît rapidement et il ne se produit pas trace de matière colorante.

D'autre part, si à une culture normale, au moment où l’on commence à percevoir une faible teinte bleue, l’on ajoute le bouillon filtré d'une culture donnant une teinte bleue intense, quelle que soit la quantité ajoutée, on ne hâte pas la production du pigment ni augmente son intensité, au contraire, comme le prouve une culture témoin.

Cen'est donc pas l'addition d'Oxydase, ou du moins de ce que la bougie laisse passer de l'Orydase, qui produit, dans l'expérience II, une faible quantité de matière colorante. Et comme la pigmentation, dans ce cas, n'apparaît que 48 heures après l'addition du bouillon oxydasique, il est permis de croire que le phénomène est dû à une nouvelle génération de bactéries chromogènes, provoquée par l'apport des éléments indispensables au développement de cette fonction,