ARTE) ACCÉIQUES, ANT PES 20 CC
Acide azotique o,1 N .......... 20 CC Ne. de soude. 277.4. : li O gr. O4.
que nous avons porté comme d’habitude au bain-marie bouillant. La présence d’acide acétique nous plaçant très près du pH 1,8, nous nous sommes bornés à établir ce pH pour vérifier l’intensité de coloration de 1 mgr. de tryptophane.
Nous avons obtenu le chiffre 0,165, alors qu’en réalité nous aurions dû obtenir 0,14.
Pour la tyrosine, nous avons opéré la réaction sur le mélange suivant :
AVOIR LAS A re Le PARA RAR TU Aide ACOtIQUe dl rs nan 100 cc.
Acide azotique o;z N .,........ 100 cc.
Nitrite de soude -............. O gr 20.
Comme intensité de coloration pour 1 mgr. de tyrosine, nous avons obtenu 0,16, chiffre exact que nous avons
- déjà pu établir précédemment.
On peut donc dire que la présence d’acide acétique ne gêne pas sensiblement la réaction ; cependant elle la complique considérablement, en particulier pour l’établissement du pH 8,6. Pour le pH 1,8 rien n’est plus simple,
me
car une fois la nitration faite, la liqueur se trouve la plupart du temps au voisinage du pH 1,8. Mais pour arriver au pH 8,6, comme on doit neutraliser à la soude, on se trouve en présence du mélange tampon acide acétique — acétate soude, qui met dans l’impossibilité d’utiliser les tampons courants pour le pH 8,6. Il faut d’autre part employer des volumes considérables de solution de soude.
Il y a donc nécessité d'opérer d’une façon empirique, de neutraliser la liqueur à la lessive de soude pure, puis de lalcaliniser peu à peu jusqu’au pH 8,6 en la comparant à ‘une solution étalon à pH 8,6 en présence de bleu de bromothymol. Cette méthode est d’ailleurs celle que nous avons préconisée dans la technique que nous avons exposée plus haut. Il nous est fréquemment arrivé en effet d’avoir à faire à des dissolutions de matières protéiques faites dans de la soude ou de l’acide acétique et nous avons dû constamment vérifier le pH de cette sorte.
Nous nous sommes ensuite demandés si nous ne pourrions pas augmenter les concentrations des matières protéiques de façon à avoir des intensités de coloration beaucoup plus fortes et à. pouvoir employer comme pour la réaction de Millon le colorimètre de Duboscq à la place du colorimètre de Moreau.
Nous avons essayé les concentrations suivantes :
Tyrosine ou Tryptophane ...... 20 mgr.
Acide acétique ..... NE 20 ACC:
Acide azotique 0,1 N .......... 20 cc.
Nitrite de soude tienne O gr. 16.
en faisant varier les quantités relatives d’acide azotique et de nitrite de soude.
Nous avons obtenu les résultats suivants :
Intensités de coloration exprimées en milligrammes de m. nitrophénol
NOH O,1N : | NOËH ON : | NOSH ON :
Normales | 20 cc. 4OCC: 20kCc:
NOPNa : Ogr. 16[NO?Na : 0 gr. 16/NO?Na : O gr. 32 Tyrosine :
PERS \ 0,16 0.12 0,09 0,16 DÉS OS y 21 4,75 4,73 Tryptophane MEL Faut 0,14 0,10 0,15 a UN Re 146 | 1,40 DA 70e 0.98 0,98
En opérant donc dans les conditions du troisième essai, on peut se permettre d'augmenter la concentration en matière protéique et il est possible dans ce cas d’utiliser le colorimètre de Duboscq.
2. - Adaptation de la réaction xanthoprotéique au dosage séparé de la tyrosine et du tryptophane au moyen du sulfate mercurique.
Nous avons songé qu'il serait peut-être possible d’utiliser dans la méthode xanthoprotéique la précipitation du tryptophane au moyen du sulfate mercurique préconisée par Folin et Marenzi dans leur méthode au réactif phosphomolybdotungstique. En effet, la tyrosine et le tryptophane une fois séparés ne pourraient-ils pas subir la réaction xanthoprotéique ?
Il convenait donc de s’assurer que la présence de sulfate mercurique n’entravait pas la réaction.
Notre idée primitive était d’incorporer au dosage de Folin et Marenzi un dosage basé sur la réaction xanthoprotéique. Nous avons donc voulu placer nos acides aminés (tyrosine et tryptophane) exacñement ‘dans les mêmes conditions où ils se trouvent dans la méthode de Folin et Marenzi. De plus, pour être sûrs que, même lorsqu'il se trouvera en grand excès le sulfate mercurique n’entravera pas la réaction, nous avons placé nos acides aminés en contact avec un excès de sulfate mercurique.
Pour le tryptophane, nous avons donc opéré sur les quantités suivantes
Erypnlôphané ii Sea 2 mgr.
Sulfate mercurique pur ........ 60 mgr.
Acide chlorhydrique 0,1 N ..... TO CC:
Après dissolution, nous avons placé la liqueur au bain-marie bouillant pendant 30 minutes. Nous avons filtré sur un petit filtre, bien qu’il n’y ait aucun résidu apparent, puis nous avons complété à 30 cc. avec de l’acide azotique décinormal accompagné de o gr. 10 de nitrite de soude. Nous avons porté au bain-marie bouillant pendant 45 minutes. Après refroidissement nous avons complété le volume à 30 cc.
Nous avons ensuite porté la liqueur au pH 1,8 et 8,6. Or, à partir du pH 7,0, l’addition de soude provoque un précipité abondant d’oxyde de mercure. Nous avons pensé éviter ce précipité en additionnant la liqueur xanthoprotéique refroidie de 2 cc. d’une solution de cyanure de
sodium à 5 %. Nous n’avons constaté en effet par la suite aucun précipité à la neutralisation.
Nous nous sommes ensuite placés aux pH 1,8 et 8,6 et nous avons constaté que les intensités de coloration de 1 mgr. de tryptophane étaient bien ainsi les mêmes que celles que nous avions calculées ‘
En effet au pH 1,8, Î — 0,133 au lieu de o,14 précédemment trouvé.
Au pH 8,6, Î — 1,458 au lieu de 1,46 précédemment trouvé.
Pour le tryptophane donc il n’y a aucun inconvénient à le doser en présence de sulfate mercurique.
Pour la tyrosine au contraire, il n’en est plus de même. La réaction serait en effet possible si nous étions dans les
mêmes conditions que pour le tryptophane. Mais après la séparation de ce dernier, la tyrosine se trouve accompagnée de sulfate mercurique en solution dans de l’acide sulfurique sensiblement 2 N ; ce qui fait que lorsque nous nous disposions à opérer la réaction xanthoprotéique, c’est une réaction de Millon qui se développait immédiatement dès que nous ajoutions le nitrite de soude.
On peut cependant tourner cette difficulté et incorporer au dosage de Folin et Marenzi deux dosages séparés de la tyrosine et du tryptophane au moyen de la réaction xanthoprotéique. ail l
En effet, avant d'opérer la séparation de ces deux corps dans la substance protéique considérée, il suffit de
pratiquer une réaction xanthoprotéique, et en nous plaçant au pH qui nous donnera le maximum d’intensité de teinte et la lecture au colorimètre la plus facile, c’est-à-dire au
pH 8,6, nous obtiendrons une première valeur de l'intensité de coloration F, donnée à la fois par la tyrosine et le tryptophane. Quand nous aurons séparé ce dernier, nous pourrons établir pour lui une autre valeur de l'intensité de coloration f, valeur qui lui sera particulière.
Il sera alors facile de calculer F-f, qui représentera la valeur de l’intensité de coloration de la tyrosine. Nous déduirons la quantité de tyrosine contenue dans la prise
d’essai ainsi qu’il suit :
F-f x = ——— milligrammes de tyrosine.
4,75 et la quantité de tryptophane de la façon suivante f y == ———— milligrammes de tryptophane 1,46
Nous avons utilisé cette méthode pour diverses matières
Caséine
Fibrine desséchée
protéiques ; voici les résultats que nous avons obtenus : Albumine Gélatine Edestine
d'œuf de Chènevis
AN ioene 3,84 0 4,03
pour cent 3,94 (0) 4,17 3,70 0
ropuane | 1 | 0 | 1 pour cent 1,02 0 ?
Les résultats obtenus pour commentés au chapitre IV.
le tryptophane
sont
Quant à ceux fournis par le dosage de la tyrosine par différence, tel qu’il est indiqué dans les pages précédentes, ils sont trop différents de ceux des autres méthodes pour qu’il y ait intérêt à les comparer. Ces résultats très aberrants sont probablement dus en grande partie à la méthode par différence utilisée.
AE SAUCE a LORNUES h
