CHAPITRE IV
ÉTUDE DE LA MÉTHODE DE FOLIN ET MARENZI POUR LE DOSAGE DE LA TYROSINE ET DU TRYPTOPHANE DANS LES MATIÈRES PROTÉIQUES
Essais de modification
Rappelons le principe de cette méthode dont nous avons exposé plus haut l’historique : on commence par hydrolyser la substance protéique, puis on sépare la tyrosine du tryptophane, en précipitant ce dernier par addition de sulfate mercurique. On dose la tyrosine par une réactior de Millon semblable à celle que nous venons d’étudier plus haut, et le tryptophane par le réactif des phénols de Folin et Cioccalteu [5].
Description de la méthode :
1° Hydrolyse de la substance protéique.
Dans un tube pyrex de 150 M sur 16 4 introduire un poids d’albuminoïde voisin de 100 mgr. exactement
2208 ee
pesé, avec 2 cc. de soude à 20 % de Na OH pure. Chauffer légèrement pour dissoudre et fermer le tube au moyen d’un bouchon de liège, recouvert d’un papier d’étain et surmonté d’un tube de 50 ©, formant condensateur. Laissez au bain-marie bouillant de 12 à 18 heures selon la matière protéique utilisée (pour l’albumine de l’œuf de 12 à 14 heures ; pour la globuline de 14 à 18 heures ; pour la caséine, temps d’hydrolyse beaucoup plus long, on pourrait utiliser avec succès le bain d’huile).
Puis à la solution chaude ajouter 3 cc. de SO‘ H° 7 N (concentration nécessaire pour précipiter la silice des tubes pyrex qui pourrait rester à l’état colloïdal). Refroidir et transférer dans une fiole jaugée de 25 cc., à l’aide d’une petite quantité d’eau. Compléter à 25 cc. Ajouter de 0 gr. 20 à o gr. 50 de kaolin, agiter et filtrer sur un petit filtre de 9 , (couvrir l’entonnoir, car la filtration est lente). On recueille 20 cc. de filtrat.
2° Séparation du tryptophane.
On introduit ces 20 cc. de filtrat dans un tube conique de centrifugeur de 50 cc. avec 4 cc. de solution de sulfate mercurique rigoureusement exempt de sulfate mercureux, faite de 15 gr. de SO Hg pour 85 gr. de SO‘H? 6N et versée goutte à goutte, à une distance du niveau du liquide qui ne sera pas inférieure à 3 ©,. Bien agiter et laisser reposer 2 à 3 heures (temps minimum 2 heures). Centrifuger de 5 à ro minutes. Dans ces conditions d’acidité, le tryptophane est précipité en n’entraînant qu’une faible quantité de tyrosine et aussi toute la cystine.
Décanter dans une fiole jaugée de 100 cc. et laver les bords du tube avec r cc. de SO‘ H? N/7r0. Verser dans le tube 10 cc. de solution de SO‘ Hg à 1,5 % dans SO‘ H? 2 N et mettre le précipité en suspension à l’aide d’un agitateur que l’on rince ensuite avec 2 cc. de la même solution. Laisser reposer 10 minutes puis, centrifuger à nouveau. Verser la liqueur surnageante dans la fiole de 100 cc. Pour terminer la séparation, faire un lavage identique avec 10 cc. de SO H? N/r0 et rincer les bords du tube avec r cc. de SO H? N/ro.
3° Dosage de la Tyrosine.
La liqueur contenue dans la fiole de 100 cc. qui renferme la tyrosine est comparée avec une solution type de tyrosine de même titre en SO‘ H°?. Pour préparer cette solution type il faut opérer le mélange suivant :
Solution de tyrosine à 1 % dans SO‘H° 2 N..... 4 CC. RE TE bre den Me rain res Solution de SO‘ Hg à 15 % dans SOfH? 6 N.... 4 cc. Solution de SO‘ Hg à 1,5 % dans SOfH? 2N.. 712 cc. STATE NN TOR PR Rr E4 CC.
DER ES ON ÉCRIN SP ERREUR ET EE 6 cc.
Placer ces deux solutions en même temps au bainmarie bouillant pendant 5 minutes. Refroidir et ajouter, dans chaque flacon, 1 cc. de solution de nitrite de soude à 2 % ; après 2 minutes de contact, diluer à 100 cc. et faire la comparaison aussitôt au colorimètre.
Cale = 4 X720;0u 80 divisé par le nombre de
divisions du colorimètre, lorsque la solution type est placée sous 20 %,, donne la proportion de tyrosine en milligr. contenue dans les 20 cc. d’hydrolyse.
Remarque. — Il est essentiel que l’acidité des 2 solutions soit la même, après dilution à 100 cc.
4° Dosage du Tryptophane.
Pour cela, employer l’une des 2 méthodes décrites par Folin et Cioccalteu. Toutefois les auteurs conseillent la méthode suivante qu’ils préfèrent à celle qui utilise l'élimination du mercure par l'hydrogène sulfuré.
Au précipité contenu dans le tube pyrex ajouter 10 cc. d'H CIN. Placer au bain-marie bouillant pendant trente minutes, opération indispensable pour décomposer le complexe mercure-tryptophane. Il peut arriver qu’une trace de matières insolubles reste dans le tube. Vérifier que ce résidu ne donne aucune coloration avec le réactif des phénols. Refroidir la solution chaude et filtrer dans une fiole jaugée de 100 cc. Laver le filtre jusqu’à obtention d’un volume d’environ 60 cc. Dans une autre fiole de 100 cc., introduire r mgr. de tyrosine et diluer à 60 cc.
Dans chaque flacon ajouter 25 cc. de solution saturée de carbonate de soude (qui ne devra pas avoir été en contact avec un bouchon de caoutchouc). Mélanger, ajouter. s cc. de réactif des phénols de Folin et Cioccalteu Agiter, laisser reposer 5 minutes. Ajouter 2 à 3 cc. de solution de cyanure de sodium à 5 %. Amenér à 100 ct. et comparer à la solution type de tyrosine sous 20 %.
