Utilisation de la réaction de Millon comme dosage

Méthode de Thomas :

En 1921, Thomas [29] résolut d’utiliser cette réaction au dosage des corps à fonction phénol des matières protéiques. Contrairement à ce qui était alors admis, Thomas a constaté que même après hydrolyse le tryptophane et l’oxytryptophane donnaient une coloration rose. Pour éliminer le tryptophane, il le précipitait avec du sulfate mercurique, l’oxytryptophane restant en solution. Ne pouvant espérer doser de la tyrosine pure, Thomas dût se contenter de calculer en tyrosine un chiffre représentant l’ensemble des produits d’hydrolyse de nature phénolique correspondant à la substance protéique étudiée. Il a désigné ce chiffre sous le nom d’indice de Millon ou indice phénolique.

Dans le procédé indiqué par Thomas, on hydrolyse la matière protéique par ébullition pendant 12 heures avec de l'acide sulfurique dilué qu’on précipite par la suite avec de la baryte. On précipite le tryptophane en milieu nitrique au moyen d’une solution de nitrate mercurique pur. On décolore par le noir animal et on effectue la réaction de Millon. Après deux heures de repos, on compare avec une solution type de tyrosine soumise au même traitement.

Dans ces conditions Thomas admet qu’il n’y a entrainement de la tyrosine ni par la baryte, ni par le nitrate mercurique, ni par le noir animal. Il a pu vérifier qu’il n’y a pas formation pendant l’hydrolyse de produits phénoliques entrainables par la vapeur d’eau. |

T0 Méthode de Zuwerkalow [33] :

Cette méthode est beaucoup plus simple que la précédente, car elle ne nécessite pas d’hydrolyse. Elle consiste à faire une dissolution aqueuse ou sodique de la matière protéique, de lui faire subir l’action du sulfate mercurique et du nitrite de soude en présence d’acide acétique, en chauffant le liquide jusqu'à début d’ébullition.

La coloration obtenue est comparée à celle obtenue dans les mêmes conditions avec une solution étalon de tyrosine.

Dans ces conditions Zuwerkalow prétend obtenir les mêmes résultats qu’en opérant une hydrolyse préalable. Il a constaté de plus que le tryptophane ne gêne pas la réaction.

Nous avons étudié cette méthode dans le chapitre I de notre travail.

Procédé de Folin et Cioccalteu [5] :

La réaction de Millon a été utilisée par ces auteurs au cours de dosages séparés de la tyrosine et du tryptophane dans les matières protéiques. Folin et Cioccalteu au cours d’un essai de séparation du tryptophane au moyen du sulfate mercurique ont constaté qu’une coloration rouge s’établissait directement à froid sur le liquide de filtration, si on l’additionnait de nitrite de soude. Cette réaction qui avait lieu à froid était due au contact prolongé de la liqueur avec le sulfate mercurique. Or, dans la technique de la réaction de Millon jusqu'ici utilisée,

le fait de chauffer rendait la coloration instable et les résultats variables.

Les auteurs ont donc établi une nouvelle méthode de dosage séparé de la tyrosine et du tryptophane, en tenant compte de la possibilité de faire la réaction de Millon à froid, la tyrosine étant dosée par la réaction de Millon et le tryptophane au moyen d’un autre réactif dont nous parlerons dans la suite. Cependant si l’on veut pouvoir utiliser cette réaction pour une détermination quantitative de la tyrosine, il est indispensable que la solution standard dont on se servira, ainsi que les liquides de filtration, aient la même composition en acide et la même teneur en sulfate mercurique, et d’autre part il faut éliminer tout tryptophane, la moindre trace de ce corps étant susceptible de provoquer un louche gênant.

Principe de la méthode :

On précipite le tryptophane, dans les hydrolysats, à l’aide d’une solution de sulfate mercurique. On centrifuge; la liqueur surnageante chauffée, après avoir été adaptée à un titre d’acidité déterminé, est additionnée à froid de nitrite de soude. Il se développe une coloration rouge que l’on compare à celle d’une solution de tyrosine traitée d’une façon identique.

Procédé de Folin et Marenzi [8| :

Cette méthode est calquée sur la précédente. Elle ne diffère de cette dernière que par le mode d’hydrolyse qui s’effectue au bain-marie et non à feu nu. D’autre part le temps de chauffage nécessaire à la réaction de Millon est réduit de 15 à 5 minutes.

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Ensuite, les auteurs conseillent dans le cas d’une hydrolvse acide l’emploi de l’acide sulfurique et non par exemple d’acide chlorhydrique qui empêcherait la réaction de Millon. | |

Nous avons étudié cette méthode ; nous en exposerons la technique détaillée dans le chapitre correspondant.

Procédé de Mac Farlane et Fulmer [201

Ce procédé qui comporte un dosage de tyrosine au moyen de la réaction de Millon ne diffère des deux méthodes dernièrement exposées que par une hydrolyse préalable au moyen d’enzymes. Nous reviendrons plus loin sur cette méthode que nous avons étudiée dans notre travail.

b) LA RÉACTION XANTHOPROTÉIQUE

Son origine. - Ses modifications. - Variations en fonction du pH

La coloration jaune observée, lorsqu'on traite des matières protéiques par l’acide nitrique, est connue depuis fort longtemps sous le nom de réaction xanthoprotéique. Lorsque ces matières protéiques furent reconnues comme constituées par un édifice d’amino-acides, on établit rapidement que la tyrosine, l’un des premiers amino-acides connus, intervenait dans cette réaction xanthoprotéique, car elle se conduisait comme les matières protéiques visà-vis de l’acide nitrique.

La connaissance du rôle du tryptophane est d’acquisition toute récente.

C’est Fürth [9], en 1899, qui le premier avait soupçonné cette relation, en montrant que dans les produits d’hydrolyses des xanthoprotéines et des xanthomélanines on pouvait reconnaître des produits complexes, générateurs d’indol.

Mais c’est Lieben [19], qui, en 1924, établit d’une façon définitive la participation du tryptophane à la formation de dérivés nitrés des matières .protéiques. D’ailleurs, dix-sept ans auparavant, E. Abderhalden et M. Kempe [11 en 1007, dans leur étude sur le tryptophane et quelques uns de ses dérivés, avaient observé, sans plus de détail, que « le tryptophane en solution aqueuse diluée donne une coloration jaune mette par chauffage avec l'acide nitrique ).

En 1910, C. Th. Môrner [23] avait étudié attentivement cette réaction colorée du tryptophane, ainsi que celle fournie par le mélange de tyrosine et de tryptophane en examinant la variation d’intensité de la teinte, lorsqu'on passe du milieu acide au milieu alcalin. L'auteur avait constaté qu’en milieu alcalin, la coloration du tryptophane est environ 3 fois plus forte qu’en milieu acide, tandis que pour la tyrosine le même changement de réaction fait passer l’intensité de la teinte de 1 à 45. Môrner émit alors l’idée qu’il doit être possible de doser colorimétriquement un mélange de ces deux corps en se

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basant sur cette observation.

NE Ve

PE Re Méthode de Tillmann, Hirsch et Stoppel [30] : .

Tillmann, Hirsch et Stoppel, en 1928, ont mis au point une méthode basée sur l’observation de Môrner. Aprés avoir fixé, par une étude préalable, les quantités de tyrosine et de tryptophane qui correspondent (après mitration et après avoir été amenées successivement à deux pH convenablement choisis) à une quantité fixe de colorant convenablement choisi (métanitrophénol), ils déterminent à ces deux pH, sur un mélange nitré de titre inconnu la quantité de colorant correspondant à la teinte du mélange. Ils ont ainsi tous les éléments nécessaires pour déterminer la composition du mélange en tyrosine et en tryptophane.

Nous avons soumis, dans le chapitre III, à une étude attentive cette méthode qui nous était apparue comme séduisante. On en trouvera l’exposé et la discussion à cet endroit de notre travail. |

c) RÉACTION DE FOLIN

Cette réaction est basée sur la coloration bleue qui se développe lorsqu'on met en présence un corps à fonction phénol avec une solution déterminée phosphomolybdotungstique.

| Comme nous le verrons au cours de cet exposé, cette

réaction, contrairement à ce que pensait primitivement Folin, ne se produit pas seulement avec la tyrosine. Nous verrons au cours de cette étude q hane donne une coloration identique. S

Origine de cette réaction. - Variétés de réactifs

C’est O. Folin et Denis [6] qui, en 1912, ont signalé une réaction colorée des matières protéiques avec un réactif à base de tungstate et de molybdate de soude, en présence d'acide phosphorique. Ils ont constaté que la coloration bleue qui s'établit est très stable et qu’elle est proportionnelle en intensité à la quantité de tyrosine contenue dans la protéine.

En 1927, Folin et Cioccalteu [5] ont donné de ce réactif des phénols une nouvelle formule que nous avons décrite à la page 48.

Méthode de Folin et Denis [6] :

La méthode de Folin et Denis consiste essentiellement à hydrolyser la matière protéique par l’acide chlorhydrique et à ajouter à l’hydrolysat une certaine quantité d’une solution de carbonate de soude ainsi que du réactif phosphomolybdotungstique. On compare au bout de dix minutes.

Les auteurs, en 1912, estimaient que la tyrosine est le seul amino-acide des matières protéiques susceptibles de réagir avec leur réactif. Ils pensaient aussi avec Osborne que jusqu'alors les méthodes employées ne permettaient pas de séparer sans perte la tyrosine des matières protéiques, c’est pourquoi les chiffres établis auparavant étaient plus faibles. Ils ont constaté, en outre, que la tyrosine réagissait aussi bien à l’état de combinaison qu’à l’état libre ; c’est pourquoi selon eux le temps d’hydrolyse importait peu.

Critique de cette méthode par Thomas [29] :

En 1921 Thomas a repris cette méthode de Folin et Denis. Il a constaté que les chiffres obtenus sont beaucoup plus élevés que ceux qui ont été donnés auparavant et en particulier que ceux fournis par la méthode gravimétrique. Thomas ajoute que bien que l’on ait admis (Abderhalden !r]) que la tyrosine pouvait contracter une combinaison soluble avec des acides diaminés comme la lysine, on ne peut admettre que cette combinaison ait été la cause d'erreur de tous les dosages précédents. Aussi Thomas n’admet que sous la plus grande réserve les résultats trouvés par Folin et Denis. Il s’est alors proposé de soumettre leur méthode à un contrôle serré.

Il a d’abord constaté que le temps optimum nécessaire à l'établissement complet de la coloration n’était pas de 10 minutes, mais de 30 minutes. D'autre part cette coloration ne lui semble pas due uniquement à la tyrosine. En effet le tryptophane et l’oxytryptophane ont, entre les mains de Thomas, donné lieu à une coloration bleue intense même après une ébullition avec de l’acide chlorhydrique pendant 12 heures. er : D'autre part beaucoup de corps semblent aussi réagir grâce à leurs propriétés réductrices, tels les sels ferreux, lc chlorure stanneux, l’hyposulfite de soude. le sulfure d’ammonium, l’acide urique, l’alhéhyde benzoïque, . la naphtylamine, etc, corps dont l’action a été nettement établie.

En dépit des affirmations de Folin et Denis, Thomas

a pu prouver aussi que l’indol et ses dérivés réagissent sur le réactif phosphomolybdotungstique.

Thomas s’est demandé de plus si, au cours de l’hydrolyse chlorhydrique, proposée par Folin et Denis, il ne se forme pas de produits réducteurs ou de dérivés indoliques du tryptophane, et à son avis, l’on ne saurait non plus affirmer d’une façon catégorique qu’il n’existe dans les matières protéiques aucun acide aminé, inconnu jusqu’à présent, susceptible d’influer sur leur réactif.

Méthode de Folin et Looney [7] :

En 1922, Folin et Looney sont arrivés à reconnaître le bien-fondé de ces critiques. Ils établirent que seuls la tyrosine et le tryptophane donnent la réaction des phénols et que les amino-acides suivants ne la donnent pas : arginine, lysine, acide aspartique, histidine, acide glutamique, leucine, valine, asparagine et cystine.

Dans une nouvelle technique ils proposèrent alors de séparer, après hydrolyse, le tryptophane de la tyrosine par le sulfate mercurique. Dans la liqueur séparée du tryptophane on dose la tyrosine par le réactif des phénols en présence de carbonate de soude et de cyanure de sodium. Le précipité mercure-tryptophane est alors dissout au moyen de cyanure de sodium et le tryptophane à son tour est dosé par le réactif des phénols en présence de carbonate de soude.

Les auteurs d'autre part abandonnent l’hydrolyse acide et opèrent une hydrolyse par de la baryte. Les résultats, que Folin et Looney ont ainsi obtenus, n’ont été

entâchés que d’erreurs en plus ou en moins ne dépassant pas 4 %.

Méthode de Folin et Cioccalteu T5] :

En 1927, Folin, en collaboration avec Cioccalteu, a de nouveau modifié sa méthode. I] revint à l’hydrolyse alcaline en employant la soude. I] estima en outre que la séparation du tryptophane par le sulfate mercurique était incomplète et mit sur pied un nouveau mode de séparation, basé sur le même principe, mais dans lequel la tyrosine restait intégralement en solution.

Folin et Cioccalteu remplacèrent d’autre part le dosage de la tyrosine au réactif. phosphomolybdotungstique par un dosage selon la méthode de Millon effectué à froid, en profitant de ce que la tyrosine est dissoute en milieu mercurique.

Enfin pour la dissolution du précipité mercure-tryptophane les auteurs proposèrent d'employer soit l’acide chlorhydrique puis l'hydrogène sulfuré pour séparer le mercure, soit le cyanure de sodium.

Méthode de Folin et Marenzi [8] :

En 1929, Folin et Marenzi ont cherché à appliquer à de très petites doses de matières protéiques les méthodes colorimétriques jusqu'alors établies. Le principe de leur méthode est le même que celui de Folin et Cioccalteu. Les seules modifications qu’ils y apportent sont d’abord le chauffage au baïin-marie pour l’hydrolyse, puis la réduc-

tion à 5 minutes du temps de chauffage nécessaire à la réaction de Millon. Enfin dans le cas d’une hydrolyse acide, ils préconisent l'emploi de l'acide sulfurique et non

de l’acide chlorhydrique qui empêcherait la réaction de Miilon.

Méthode de Greenberg [11] :

En 1927, Greenberg a publié un procédé basé sur la réaction phosphomolybdotungstique dans lequel aucune hydrolyse n’est employée. L'auteur estime en effet que les matières protéiques donnent avec le réactif de Folin et Cioccalteu une coloration bleue dont l'intensité ne s’accentue pas après hydrolyse.

Nous avons étudié ce procédé en détail ; nous verrons qu’en appliquant dans certaines conditions bien déterminées, il permet d'obtenir des résultats constants.

Méthode de Mac Farlane et Fulmer [20] :

En 1930, Mac Farlane et Fulmer ont publié un procédé semblable à celui de Folin et Marenzi, dans lequel les hydrolyses se font par enzymes.

Les auteurs ayant eu à déterminer les quantités de tyrosine et de tryptophane contenues dans un certain nombre de farines végétales et animales ont été amenés à utiliser différentes méthodes.

Parmi celles-ci, seules les méthodes colorimétriques sont celles qu’ils ont retenues, comme étant les plus précises et les plus pratiques. Toutefois les méthodes de