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Dans le cas où plusieurs germes à étudier pousseraient bien dans le même milieu, une fois réalisée la seconde gamme de dilution de la Pénicilline, on peut répartir le contenu de chaque tube dans des tubes à hémolyse stériles à raison de 1 ec. par tubes. La pousse y est très lisible.

Au bout de 18-24 heures, on voit qu'il y a inhibition jusqu’à une certaine concentration et pousse au-delà ; on prend le titre moyen entre celui qui n’a pas poussé et celui qui à poussé. Il suffit de diviser le titre moyen du germe à étudier par celui de l’étalon pour obtenir un Index qui a été appelé Index de résistance par LicaTwirz et BERNAL. Nous préférons le terme /ndex de sensibilité qui évite la confusion que nous avons indiquée plus haut.

On sait que l’unité Oxford a été fixée par FLorey de telle façon que l’inhibition se produise à 0,02 U.O. par cc. On pourrait donc se passer de faire la série ensemencée avec le staphylocoque. Maïs les variations de la souche, du titre de la Pénicilline servant aux dilutions, et, des milieux, fait varier le chiffre de 0,06 à 0,015. Cette série est donc nécessaire.

S’1l faut la même quantité de Pénicilline pour inhiber la souche inconnue et la souche étalon, on dira que la sensibilité de la souche est de 1. Si pour l’étalon, il a fallu 0,02 U.O. et pour la souche 0,10 pour les inhiber, on dira que l’Index de sensibilité est de 5.

D’après ces auteurs, les streptocoques de la maladie d’OssLEer seraient susceptibles d’être atteints par le traitement lorsque leur index de résistance se situe entre 1 et 5. Au dessus, il serait inefficace. Cette constatation vaut à peu près pour tous les germes. Cependant, nous croyons qu’elle est surtout due au fait que des concentrations permanentes supérieures à 0,10 U.O. sont difficiles à obtenir dans le sang.

Nous verrons plus loin quelques exemples de sensibilités calculées par cette méthode.

CHABBERT 3

SR vues

MICRO-MÉTHODES DE DILUTION Méthode des « Slide Cells » de FLEMING

Dérivant d’une technique de Wricar, cette méthode permet de détecter de très faibles quantités de Pénicilline telles qu’on les rencontre dans les liquides organiques. Elle consiste à délimiter avec des bandes de papier paraffiné de petites cellules sur une lame de verre chauffée dans la flamme d’un bec bunsen. On les remplit avec une micro-pipette et l’on recouvre d’une seconde lame légèrement chauffée aussi. On lute le tour à la paraffine pour éviter l’évaporation. On a ainsi de très petites quantités étalées sur une surface assez large que l’on pourra ensuite facilement examiner.

Nous décrirons le détail de cette technique dans les techniques avec hémolyse, car c’est cette modification qui est employée actuellement par FremixG. Dans sa technique primitive, 1l effectuait des dilutions du sérum à examiner sous un volume de 50 mm° que l’on ensemençait ensuite avec 2 mm° d’une culture de staphylocoque standard diluée au 1/5.000". Les cellules refermées étaient placées à l’étuve. Les germes croissent en colonies séparées que l’on distingue facilement. Il ne faudrait ajouter pas plus de 15 à 50 staphylocoques vivants, de manière qu’il n’y ait que 15 à 50 colonies sur chaque cellule. C’est en raison des difficultés d’ensemencement que cette méthode a été abandonnée.

6 Technique de GARROD

L. P. GarRoD propose une technique simplifiée. On ponetionne avec une aiguille de FRANKE, on recueille le sang dans un tube capillaire stérile, on le laisse coaguler et on le centrifuge. Une goutte de 5 à 10 mm° de sérum à examiner est placée à une extrémité d’un porte-objet stérile sur lequel on a mis au préalable, à une distance

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convenable, trois gouttes égales à la première de sérum normal (sérum sanguin d’une personne saine non traitée à la Pénicilline). On dilue le sérum à examiner au demi et au quart avec une seconde goutte du sérum à examiner et les deux premières du sérum normal. La troïsième goutte du sérum normal servira de contrôle.

Les dilutions obtenues sont donc

1 — 1/2 — 1/4 — Témoin.

Chaque goutte est ensemencée avec une petite quantité de staphylocoque doré, souche H, c’est-à-dire avec 0,5 mm° d’une culture sur bouillon de 16 à 24 heures diluée au 1/1.000” (très petite anse). Chaque goutte ensemencée est recouverte avec une lamelle couvre-objet stérile et scellée à la paraffine ou à la vaseline et mise à l’étuve pendant quatre heures. On peut faire une série semblable en partant d’une goutte de Pénicilline titrant RUE

Aucune colonie ne se développe dans les alvéoles du porte-objet qui contiennent suffisamment de Pénicilline. Quand la concentration est presque inhibitrice, le nombre des colonies est inférieur à celui de la goutte de contrôle. Quand la concentration est de l’ordre de la moitié au moins du minimum requis pour l’inhibition complète, on comptera approximativement autant de colonies que dans la goutte de contrôle. I. P. Garron estime que la concentration de Pénicilline correspondant à une inhibition complète dans l’alvéole avec du sérum pur et, partielle avec le sérum dilué au 1/2, doit être considérée comme satisfaisante si l’infection traitée n’est pas moins sensible que le staphylocoque standard. Elle est probablement celle qu’il faut pour obtenir un bon effet thérapeutique.

Méthode des tubes capillaires de FLEMING

On mesure 25 mm“ de sérum, dilué ou non, on le mélange avec 2,5 mm° de culture de staphylocoque dilué au

1/1.000" et on introduit les mélanges dans des tubes capillaires de telle façon que les colonnes de liquide soient de 5 em. environ. On ferme les capillaires et on les pose horizontalement dans l’étuve. On apprécie ensuite le développement. Cette technique a aussi été modifiée pour être employée avec comme témoin l’hémolyse produite avec un streptocoque. Ce qui donne une lecture meilleure.

MÉTHODES HÉMOLYTIQUES

Dans toutes les méthodes que nous avons vues depuis le début, le phénomène observé était la pousse microbienne saisie directement soit par augmentation de l’opacité du milieu, soit par observation directe des colonies ; dans les méthodes que nous allons voir maintenant, la pousse ést saisie indirectement à l’aide d’un indicateur.

Méthode de WIiLsoN

On utilise l’hémolyse comme indicateur de titrage. La technique, ne demandant pas plus de trois heures à trois heures et demie, n’a pas besoin d’être aseptique.

Technique : On dilue l’échantillon de telle façon qu'il contienne approximativement 1 U.O. par ce. et on etfectue ensuite des dilutions sériées en bouillon. On prend un cc. de chaque solution, on les place respectivement dans un tube à hémolyse et on ajoute à chacun 0,2 cc. d’une suspension contenant 500 à 700 X 10 streptocoques du groupe & B hémolytique et 0,8 ce. d’une suspension à 5 % d’hématies de mouton ; on mélange et on met au bain-marie pendant trois heures. On centrifuge et on examine l’hémolyse. Pour éviter la présence d’hémolysines préformées, on cultive sur Agar et on lave avee du bouillon avant l’emploi. Le caleul se fait par rapport à une gamme étalon.

Rakre en faisant les dilutions en milieu au cœur de bœuf et en employant une souche spéciale de streptoco-

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que a réduit le temps de dosage à 55-90 minutes, à condition d’ensemencer avec des germes en état de division active.

Méthode de RAMMELKAMP

RammeLxamp utilise un streptocoque hémolytique particulièrement sensible. La méthode consiste à faire deux séries de dilutions. La première, en partant de 0,2 cc. de sérum ou de plasma pur, la seconde, à partir d’une pénicilline contenant 20 U.O. au ce. en eau physiologique. I] ajoute 0,5 ce. de bouillon contenant 1.000 à 10.000 strepto par cc. et une suspension d’hématies à 1 %. On cultive pendant dix-huit heures et on examine les tubes pour rechercher l’hémolyse. L'absence d’hémolyse indique que la culture ne s’est pas développée dans le tube correspondant. La comparaison entre les deux séries permet d’effectuer le titrage. La méthode s’applique à tous les liquides organiques.

Une modification intéressante de cette technique a été mise au point à l’Institut Pasteur, par B. Sureau et F. Depix. Comme les précédentes, elle a pour but de noter le taux de Pénicilline ou de milieu étudié, qui inhibe la croissance d’un streptocoque hémolytique standard.

Technique : On fait dans des tubes à hémolyse stérile deux séries de dilutions croissantes, la première série comporte une échelle de concentrations connues en Pénicilline entre 1/20 et 1/200 ; la deuxième est faite à partir de la solution à titrer (pour le sang entre 1 et 1/100). Les dilutions se font dans du sérum normal. On ajoute ensuite dans chaque tube une goutte de sang défibriné servant d’indicateur et une goutte d’une culture au 1/100 de streptocoque de dix-huit heures en bouillon aseite. On place les tubes sur un agitateur lent qui facilite l’hémolyse. L’appareïl est placé dans une étuve à 37° pendant cingq-six heures. Au bout de ce laps de temps, on note la limite inférieure de l’hémolyse dans la série des dilutions

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du milieu étudié. Par comparaison avec les dilutions de concentration connue, on calcule la concentration en substance active du milieu à étudier. Toutes ces opérations doivent être faites stérilement, la présence d’autres miero-organismes pouvant annihiler l’activité antibiotique de la Pénicilline.

La méthode est applicable à tous les milieux organiques stériles.

Micro-méthodes hémolytiques de FLEMING

Après avoir utilisé pendant quelque temps la méthode des « Slide Cells » et celle des tubes capillaires suivant la technique décrite plus haut, en 1944, FLEMING, en raison des grandes difficultés d’un ensemencement égal, les transforma en méthodes hémolytiques. Ù

A. « Slide Cells » :

Technique : On prépare sur une lame ordinaire six compartiments délimités par des bandes de papier — (papier de revue faisant 0,2 mm. d'épaisseur) — trempées dans de la paraffine très chaude, dans un mélange de paraffine et d’huile de paraffine ou même dans de la vaseline. Les compartiments font environ 20 mm. de long sur 12,5 mm. de large, ils contiennent à peu près 90 mm°. On recouvre la lame avec une deuxième lame chauffée.

On peut effectuer les dilutions du sérum à titrer de deux manières : D. HæiLLmax les fait dans des tubes à hémolyse en diluant le liquide à examiner avec du sérum physiologique, puis en ajoutant dans chaque tube du milieu, du streptocoque hémolytique et des globules rouges. Il porte ensuite 25 mum° de chacun de ces tubes dans les cellules, FLEmING fait directement les dilutions dans les cellules. On se sert d’une micro-pipette pouvant mesurer 25 mm, on dépose dans les six cases de la lame 25 mm