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avec de l’eau; on décante les parties les plus fines qu'on met à part; on jette la bouillie restante sur le tampon et l’on essore.

» Enfin, on termine la préparation du filtre en y faisant passer les portions les plus fines de l’amiante qu'on a séparées par broyage et décantation. La dernière couche ainsi obtenue, celle qui agit vraiment comme filtre, doit avoir au moins 2" à 3°" d'épaisseur; les deux premières lui servent simplement de support; elles ont ensemble à peu près 1°". On doit veiller à ce que chaque couche ait une épaisseur régulière et une surface horizontale. Quand on a un peu d'habitude, il suffit de quelques instants pour préparer un très bon filtre d'amiante pouvant servir à un très grand nombre de dosages (quelquefois plusieurs centaines). »

En filtrant et en lavant j'ai eu soin d'opérer de manière à laisser presque tout l’oxyde cuivreux dans la fiole et à ne presque pas en avoir sur le filtre. Après avoir vidé les eaux de lavage du récipient de l'appareil de filtration et l'avoir bien rincé à l’eau distillée j'ai mis 6°" de la liqueur ferrique GC sur l’oxydule de cuivre; j'ai alors lavé la fiole, où j'avais dissous l’oxyde cuivreux, à plusieurs reprises avec quelques centimètres cubes de la liqueur ferrique jusqu’à en avoir employé 20°" en tout, en versant toujours ces liquides de lavage sur le filtre eten m’aidant pour cela d’une petite baguette en verre. Enfin j'ai lavé la fiole et lentonnoir deux fois avec 10°% d’eau distillée à la fois en repassant de la même manière ces liquides sur le tube à amiante.

De cette façon tout l’oxydule se trouvait rassemblé en solution à l’état de sulfate de cuivre, dans la fiole épaisse à filtration, le sulfate ferrique étant passé à l’état de sulfate ferreux pour une quantité correspondant à celle de l’oxyde cuivreux.

J'ai alors déterminé la quantité de sulfate ferreux formée par un Litrage au permanganate (liqueur D) et, à l’aide des Tableaux de G. Bertrand, j'ai calculé la teneur en glucose du milieu témoin.

Des essais préliminaires m’ayant montré que la proportion de glucose restant dans les cultures était très faible, j'ai été forcé de concentrer les liqueurs déféquées. J’ai même été obligé d'opérer celte concentration dans le vase où je devais effectuer la réduction de la liqueur cuivrique; dans ce but j'ai taré une fiole d'Erlenmeyer de 150°%° en verre d’léna, choisi aussi épais que possible; J'y ai versé une partie de la liqueur à concentrer, et je l’ai placé

sur les rondelles d’un bain-marie bouillant après l’avoir relié à une trompe à eau, par l'intermédiaire d’un réfrigérant et d’une fiole épaisse tubulée. J'ai alors fait le vide que j'ai maintenu seulement à 350" de mercure à cause du peu de résistance du vase d’évaporalion et, par des additions successives de liqueur sucrée et finalement d’un peu d’eau de lavage, j'ai concentré dans ma fiole conique tarée les quelques centigrammes de glucose que J'avais à doser pour chacune de mes liqueurs.

Connaissant le poids de mes deux fioles il m'a été facile d’amener la solution sucrée au volume de 20°" et de déterminer la quantité de sucre exactement dans les mêmes conditions que pour le témoin.

Voici les résultats que j'ai obtenus :

Glucose dans 50% de milieu.

: g NEIL MON SEE ee ee co cun 1,374 Coliniee DEPrORMENER ER eee mood uce 0,019 Bulturerder 27 OEM PERTE ee 0,015

La quantité de sucre introduite dans chaque fiole de culture étant la même que pour le témoin, il s'ensuit que le Proteus V a consommé 98,6 pour 100 du glucose et le Proteus M 98,9, c’està-dire pratiquement la même chose. Les deux microbes possèdent donc à l'égard du glucose une action quantitativement identique.

LÉVULOSE.

J'ai opéré sur le lévulose préparé avec de l’inuline et purifié par trois cristallisations dans l’alcool absolu. Comme on sait que Île pouvoir rotatoire de cette substance est modifié par le chauffage et que je tenais à éviter Loute altération quelle qu’en soit la nature, j'ai stérilisé par filtration, sur bougie de porcelaine Chamberland, mon milieu sucré. Celui-ci a été préparé dans les mêmes conditions que pour le glucose, si ce n’est que, prévoyant une baisse de concentration à la suite de la filtration, j'ai élevé à 3,5 pour 100 la teneur en sucre.

A cause des pertes inhérentes à la stérilisation à froid j’ai préparé 400°%° d’eau peptonée lévulosée, que j'ai filtrée sur bougie à l’aide

RS r —

de l'appareil de Martin à ballon de répartition. J’ai transvasé aseptiquement le liquide stérile dans une fiole à fond plat stérilisée à sec, puis à l’aide d’une pipette à deux traits également stérilisée, j'y ai prélevé six fois de suite 50°" que j'ai répartis dans six fioles d’'Erlenmeyer renfermant chacune la même quantité de carbonate de calcium précipité pur et stérilisées au four Pasteur à THOSE

J'ai placé les six fioles à l’étuve à 39° et, après avoir vérifié au bout de 48 heures que le contenu des fioles était toujours stérile, j'ai pratiqué l’ensemencement dans les mêmes conditions que pour le glucose. Après 10 jours de séjour à 37° j'ai dosé le lévulose de la même manière que le glucose après avoir déféqué les liqueurs

dans les mêmes conditions. J'ai obtenu les résultats suivants :

Lévulose dans 5o°%° de milieu.

Milieu témoin ee RP NE 1,641 Culture de Proteus V..... Dre ue den 0,861 Culture de Pro TeusMERREPRE CR 0,447

Ces chiffres ont été calculés en utilisant, ainsi que le conseille M. G. Bertrand, le Tableau qu'il a établi pour le sucre interveru; l'erreur est d’ailleurs négligeable, La quantité de lévulose introduite dans chaque fiole de culture étant la même que pour le témoin, il en résulte que le Proteus V a consommé 45,6 pour 100 du sucre mis à sa disposition, tandis que le Proteus M en a détruit 72,8 pour 100.

Cette expérience sur le lévulose m'a donné occasion d'observer le fait suivant, sans grande importance, mais qu'il est cependant bon de noter. Comme j'avais un assez grand excédent de milieu lévulosé après avoir prélevé les 300% qui m'étaient nécessaires, j'y ai dosé immédiatement le lévulose sur deux prises identiques et j'ai trouvé une quantté de sucre correspondant à 15,310 de lévulose dans 56%; or, dans le milieu témoin (1), après 10 jours d’étuve à 37°, il n’y avait que 15,644 de lévulose. Il y avait done une perte de 0%,066 de sucre qu'il est impossible d'attribuer à une erreur dans les dosages, car j'ai analysé les deux témoins et répété au moins deux fois mes déterminations; d’ailleurs j'ai, pour tous les sucres que J'ai examinés, constaté un phénomène analogue. Je pense RE RE OR CMD Le | CU

(!) Bien entendu, j'ai vérifié que le milieu était rigoureusement aseplique.

que ces légères pertes résultent simplement de l’action prolongée de la peptone pancréatique Defresne, si riche en amino-acides, sur les différents sucres que j'ai étudiés. Maillard a d’ailleurs observé que les peptones, les polypeptides et les acides aminés réagissent sur les sucres non seulement à une température élevée, mais même à 34° (48). Il semble donc qu'il n’y a pas lieu de chercher une autre explication des faits que je viens de signaler et qui n'ont d’ailleurs pas grand intérêt car ils ne peuvent influencer les résultats, les fioles témoins et les fioles de cultures étant soumises aux influences extérieures pendant le même temps et exactement dans

les mêmes conditions.

GALACTOSE.

Pour obtenir le galactose nécessaire à mes recherches j’ai opéré, d’après Tollens (49), de la manière suivante : j'ai dissous le produit pur du commerce dans 80 pour 100 de son poids d’eau distillée maintenue à 6o° jusqu’à parfaite dissolution; à ce moment j'ai ajouté à la liqueur filtrée de l’alcool à 93° dans la proportion de 160 pour 100 du poids du sucre mis en œuvre. Jai laissé refroidir et J'ai essoré à la trompe la masse cristalline, puis j'ai soumis celle-ci à un nouveau traitement semblable au premier; j'ai alors purifié le galactose ainsi obtenu par deux nouvelles cristallisations dans l’eau distullée, et c’est le sucre résultant de cette dernière opération que j'ai employé pour mes essais, après lavoir desséché dans le vide sur l’acide sulfurique.

J'ai préparé mon milieu comme avec le glucose et chaque fiole d’Erlenmeyer contenait exactement la même quantité de galactose dissous à raison d’environ 2,8 pour 100 dans de l’eau peptonée à 2 pour 100; en un mot, toute l'expérience a été calquée exactement sur celle qui concernait le glucose, aussi bien en ce qui regarde la stérilisation et l’ensemencement que le dosage du sucre.

Les résultats ont été les suivants :

Galactose dans 5o°m%° de milieu.

On voit donc qu’en 10 jours à 37°, le Proteus V a consommé 98,9 pour 100 du sucre mis à sa disposition, et le Proteus M 94,4 pour 100, c’est-à-dire que les deux microbes sont capables

d'attaquer le galactose à peu près avec la même énergie.

SACCHAROSE.

Le saccharose dont je disposais titrant déjà 98,66 pour 100, Je me suis contenté de le purifier par une méthode simple dont voici la description : j'ai pulvérisé finement le sucre, puis je Pai traité par l’alcoo! à 85° employé en quantité exactement suffisante pour le dissoudre à la température de 70° et quand la dissolution a été achevée J'ai filtré, j'ai laissé refroidir complètement la liqueur, j'ai essoré la masse cristalline; j'ai repris celle-ci encore une fois par l'alcool à 85° de manière à tout dissoudre à 50", et ensuite j'ai additionné la solution de son volume d’alcool absolu. Après avoir bien agité j'ai abandonné le mélange au repos pendant 24 heures, j'ai essoré la masse cristalline qui s'était déposée et Je l'ai lavée à l'alcool absolu. Enfin j'ai fait sécher les cristaux de sucre à Pair libre d’abord, puis dans le vide sur l’acide sulfurique.

= Pour titrer le sucre ainsi obtenu j'ai suivi la technique indiquée par M. G. Bertrand : j'ai pesé exactement 4,55 du sucre sec et je lai mis dans une fiole conique avec 50°" d’eau distillée, j'ai ajouté 1°" d'acide chlorhydrique et, après complète dissolution, j'ai plongé la fiole dans de l’eau bouillante que j'ai maintenue à l’ébullion pendant 15 minutes. Après refroidissement j'ai neutralisé exactement la liqueur sucrée avec de la soude et à l’aide du tournesol, et je l’ai versée dans un ballon jaugé de 1 litre, en rinçant la fiole à plusieurs reprises et en réunissant les eaux de lavage dans le ballon. J'ai rempli celui-ci avec de l’eau distillée jusqu’au trait de jauge, en ayant soin de rendre la solution parfaitement homogène. Tout le sucre étant interverti, j'ai prélevé, avec une pipette à deux traits, 10°% de la liqueur sucrée que j'ai mis dans une fiole conique de 150°%° avec un égal volume d’eau distillée, et, en procédant suivant la technique habituelle, j'ai eu finalement une quantité de sulfate ferreux qui a exigé 0°"",2 de la solution de

permanganate de potassium à 5#,15 par litre. Le calcul m’a donné

mine une teneur en saccharose de 99,71 pour 100, teneur vérifiée par un second dosage.

J'ai fait le milieu et j'ai conduit l'expérience exactement comme pour le glucose.

Au bout de 10 jours d’étuve à 37° J'ai déféqué le témoin de manière à obtenir 5oo°% de liqueur et les cultures de manière à obtenir 250°% pour ne pas trop diluer les liqueurs sucrées.

Des essais préliminaires m’ayant montré que le sucre restant dans les cultures était hydrolysé seulement en partie, j'ai fait deux séries de dosages : le premier avant hydrolyse pour connaître la quantité de saccharose hydrolysé par le Proteus et le second après hydrolyse pour doser le sucre en bloc, ce qui était pour moi la donnée la plus importante.

Avant l’hydrolyse Les résultats ont été les suivants :

Sucre interverti par 5o°% de milieu.

Me MTÉMON ter menée co too D 0,005 CIE ERP ACTE ULSN EEE EE 0,231 Gulturerde 270 tEUSEMERE CE Re CO NT40

Le dosage de la petite quantité de sucre interverti donnée par le témoin n’est peut-être pas absolument exact parce que, ce sucre se trouvant en solution très étendue, la méthode est moins rigoureuse. Quoi qu'il en soit, le saccharose employé ne réduisant absolument pas la liqueur cuivrique alcaline, cette petite interversion est due vraisemblablement à Paction de l’eau, de la péptone et des acides aminés sous l'influence de la haute température de la stérilisation et du séjour à l’étuve. On voit en somme que les deux Proteus sécrètent une sucrase, le Proteus V étant plus actif à cet égard que le Proteus M.

Après hydrolyse, les résultats calculés en saccharose ont été :

Saccharose par 5otm de milieu.

É NE DS NON en ee cle nent 1,413 CUITULe der PAOLEUSNE 0,259 Ce CE PANTIN ENSMER TO Ee 0,467

Le Proteus V à done détruit 81,6 pour 100 de la quantité de saccharose dont il disposait et le Proteus M seulement

66,8 pour 100. Du saccharose non détruit le Proteus V a interverti 85 pour 100 et le Proteus M 30 pour 100. Il semble du reste assez probable que les deux Proteus ne détruisent le saccha-

rose qu'après lavoir préalablement hydrolysé.

LACTOSE.

Le lactose pur du commerce que je possédais titrait seulement 06,59 de sucre à une molécule d'eau; je n'ai donc pu l'utiliser tel quel et je lai purifié par deux cristallisations dans l’eau. Pour cela je lai dissous dans trois fois son poids d’eau distillée chaude; J'ai ajouté à la liqueur un peu de noir animal lavé et je l’ai maintenue au bain-marie bouillant pendant une demi-heure en agitant fréquemment. J'ai alors filtré cette solution que j'ai abandonnée à elle-même pendant 24 heures; j'ai essoré les cristaux qui s'étaient déposés et je les ai redissous également dans trois fois leur poids d'eau bouillante en laissant le mélange au bain-marie jusqu'à dissolution complète. J'ai ainsi obtenu une liqueur parfaitement limpide que j'ai abandonnée au refroidissement jusqu'au début de la cristallisation ; à partir de ce moment j'ai agité très souvent la fiole qui la contenait afin d'obtenir des cristaux de très petite tulle; je les ai laissés se rassembler jusqu’au lendemain, je les ai essorés à la trompe, puis lavés avec à peu près trois fois leur poids d'alcool à 50°. J'ai laissé sécher à l'air et à Pabmi de la poussière la poudre cristalline ainsi obtenue et enfin je l’ai maintenue dans le vide, sur l'acide sulfurique, jusqu’à poids constant. Le sucre résultant de ces diverses opérations Utrait alors 99,29 pour 100 de lactose à une molécule d’eau de cristallisation.

J'ai préparé le milieu avec de l'eau peptonée comme pour les autres sucres et J'ai conduit l'expérience exactement de la même manière. Le milieu témoin et les cultures des deux Proteus sont restés côte à côte à 57° pendant 10 jours au bout desquels je les ai sorts de létuve. J'ai pratiqué les dosages comme d'habitude, mais comme des essais antérieurs m'avaient montré que la qe uté de lactose consommée e par les microbes était très peute, j'ai amené au volume de 500!" les trois liqueurs déféquées à examiner.

Ainsi que l'ont fait remarquer MM. G. Bertrand et G. Weiss-

weiler dans un cas semblable (30), il se présente ici une difficulté

qui est, actuellement, pratiquement insurmontable; elle porte sur le dosage du lactose restant, parce que celui-ci se trouve en présence d’autres sucres réducteurs, le glucose et le galactose qui résultent de son hvdrolyse par les microbes.

Avant tout, en mesurant le pouvoir réducteur des cultures après défécation, avant et après hydrolyse par l'acide chlorhydrique, je me suis assuré qu’il restait encore du lactose intact, parce qu'après l’hydrolyse le pouvoir réducteur était plus grand.

Ce qui est le plus intéressant ce n’est pas de savoir si les microbes hydrolysent plus ou moins profondément le lactose, mais bien la quantité de cette substance détruite par eux pour former des composés qui ne sont plus des sucres (acide lactique, acétique, etc.); C'esl pourquoi je me suis contenté de doser les substances réductrices en bloc après hydrolyse complète. En ramenant au lactose, par le calcul, les quantités ainsi trouvées et en comparant avec le témoin, on se fait une idée approchée de la proportion de sucre de lait transformée. Je dis approchée parce que les procédés actuels de dosage ne permettent dans ce cas que des approximations : quand on détermine la quantité de cuivre qui a été réduit, pour en déduire la teneur en matière sucrée de l'échantillon analysé, il faut en effet connaître la nature du sucre en cause, pour chercher dans les tables de G. Bertrand quelle quantité de substance réductrice lui correspond; or, dans le cas qui m'occupe, même après hydrolyse, on se trouve en présence d’un mélange de sucres (glucose et galactose), et ce n’est forcément que le pouvoir réducteur global qu’on utilise comme base des calculs.

J'ai donc hydrolysé aussi bien la liqueur fournie par le témoin que celles résultant des cultures. Pour cela je me suis conformé aux indications données par G. Bertrand et G. Weissweiler (loc. cit.) qui ont constaté qu’il suffit de porter la liqueur déféquée à l’ébullition après Pavoir additionnée d’acide chlorhydrique à 22 B. employé à la dose de 1° pour 20 de liquide sucré, lébullition devant être maintenue 45 minutes. Il est nécessaire également de placer un petit réfrigérant ascendant au-dessus du ballon dans lequel on fait Phydrolyse afin de maintenir constant le volume de la liqueur; celle-ci est abandonnée au refroidissement lorsque l'opération est terminée, puis neutralisée exactement avec la

soude, amenée à un volume connu et filtrée pour séparer le précipité d'hydrate de zinc; c’est sur la solution limpide ainsi obtenue qu'on détermine le pouvoir réducteur. Dans ces conditions J'ai

trouvé les résultats suivants :

Lactose pour 5ot%° de milieu.

Lactose hydraté. arr g g Milieu témoin......... inv 1,364 Culture de Proteus V..... 1,390 Poor Culture de Proteus M.... 1,333 TRS

Ainsi que je le fais remarquer plus haut ces résultats ne sont qu'approchés, toutefois ils sont suffisants pour le but que je poursuivais puisqu'ils montrent que le sucre de lait est attaqué, faiblementilest vrai, mais assez cependant pour qu'il ne puisse y avoir de doute. La proportion du lactose disparu est en effet de 3,1 pour 100 pour le Proteus V et de 5,4 pour 100 pour le Proteus M.

Le Proteus attaque donc le lactose contrairement à ce qu'affirment la plupart des anteurs qui se sont occupés de ce microbe. Toutefois, ainsi que je vais le montrer, cette divergence entre les résultats de leurs recherches et ceux des miennes est plutôt apparente que réelle.

în effet les bactériologistes qui ont examiné l’action saccharolytique du Proteus ont presque tous opéré qualitativement et se sont bornés à observer les changements de réaction produits par ce microbe dans les milieux sucrés; le Proteus étant un énergique producteur d’ammoniaque et d’amines, on conçoit aisément qu’une recherche peu approfondie puisse laisser l'attaque du lactose inaperçue puisqu'elle est en somme assez faible. Je l'ai vérifié en faisant des cultures en milieu lactosé non carbonaté; celles-ci se sont montrées alcalines, pour les deux variétés V et M, même au bout de 10 jours d’étuve. Un exemple encore plus suggestif, au même point de vue, m'a été fourni par des cultures réalisées dans des conditions identiques sur eau peptonée lévulosée, sans carbonate de calcium ; le Proteus M qui détruit à peu près les trois quarts du lévulose en présence de CO*Ca acidifie bien le

milieu non carbonaté, mais le Proteus V, qui consomme pourtant environ la moitié du lésulose mis à sa disposition dans le milieu additionné de carbonate de calcium, laisse alcaline la réaction des cultures en eau peptonée lévulosée sans CO*Ca. Il faut donc opérer quantitativement si l’on veut mettre en évidence d’une facon indiscutable l’action du Proteus sur certains sucres.

Parmi les auteurs qui n’ont examiné leurs cultures que qualitauvement Je n'ai trouvé que L. Gaillard (51) qui ait observé l'attaque du sucre de lait, mais les divers caractères biochimiques de l’unique germe décrit par lui comme consommant le lactose sont si différents de ceux que l’on observe communément, qu'il est difficile de mettre les propriétés qu’il a observées en opposition avec celles que tous les autres bactériologistes attribuent au Proteus vulgaris.

Pour ma part, je le répète, avec mes deux Proteus, mais seulement en opérant quantitativement, J'ai toujours observé l'attaque du lactose ; J'ai même constaté, comme on le verra plus loin, une augmentation assez remarquable de la faculté d'attaquer ce sucre en faisant subir à mes deux microbes des passages sur la viande cuite et dans l’organisme du cobaye. Toutefois je tiens à faire remarquer que, pour affirmer d'une façon indiscutable la constance de cette propriété biochimique du Proteus, il faudrait étudier quantitalivement un grand nombre d’échanullons d'origines très diverses, ce qui représenterail un travail considérable pour un résultat relativement peu important et tout à fait en dehors de mon travail, puisque je désire seulement comparer deux variétés isolées dans des conditions fort différentes.

Dans les applications courantes de la bactériologie à la clinique l'emploi des dosages pour la diagnose rapide des espèces est irréalisable. Il en est de même d’ailleurs dans les recherches d'ensemble, soit qu'il y ait un trop grand nombre d'échantillons à étudier, soit qu’il faille s'en tenir aux procédés employés par la généralité des auteurs; on en a l'exemple dans l'étude des caractères biochimiques du Proteus publiée par A. Berthelot et que J'ai déjà signalée, étude dont l’auteur montre les inconvénients de la méthode qualitative qu'il a été forcé d’adopter à regret, pour que les résultats de ses nombreux essais soient comparables avec ceux de ses prédécesseurs, et dans laquelle il indique les précau-

tions que Pextrème variabilité des pouvoirs alcaligène et acidogène du Proteus rend indispensables dans examen de son action

sur les sucres.

MALTOSE.

Le maltose que j'ai employé a été préparé en recristallisant trois fois dans l’alcool à 8o°et deux fois dans l’eaa le produit pur du commerce. J'ai préparé mon milieu de culture maltosé dans les mêmes conditions que les autres milieux sucrés ; il était neutre au tournesol et j'ai mis à peu près 15 de carbonate de calcium pur précipité dans chacune des six fioles. Après 10 jours de culture à l’'étuve à 37° j'ai prauqué la défécation comme d'habitude et amené les trois liqueurs à doser au volume de 500%,

Des essais préliminaires, faits avec et sans interversion, m'ayant montré que dans les cultures coexistaient du maltose et du glucose résultant de l'hydrolyse du premier, j'ai hydrolysé les trois solutions à analyser de manière à n'avoir à doser que du glucose. Un poids donné de ce sucre correspondant au même poids de maltose à une molécule d’eau (maltose ordinaire), j'ai déterminé ainsi très facilement la proportion de sucre détruit.

Pour hydrolyser chacune des liqueurs à essayer j'en ai versé 20°%° dans une fiole d'Erlenmeyer; après addition de 6% d'acide sulfurique au dixième, J'ai adapté la fiole à un réfrigérant ascendant et J'ai porté le liquide à l’ébullition que j'ai maintenue pendant 2 heures. Après refroidissement j'ai neutralisé et jai fait les dosages à la manière habituelle.

ên tenant compte que l’hydrolyse ne donne que 98,6 pour 100 de glucose (Tollens) les résultats obtenus sont les suivants

Maltose à 1° d’eau ou glucose pour 50% de milieu.

MITTEUSTÉMOINSR, SP ERRE RRNRRREE lo Culture deiPrateus Ne RE 0,457 Culture AePrare USM ET 1,432

Le Proteus V a donc consommé 68,1 pour 100 de maltose, mais le Proteus M n’a pas attaqué ce sucre, bien que la culture ait été aussi abondante que pour la variété V. Un nouvel essai dans les mêmes conditions m'a donné des résultats identiques, mais,

ainsi qu'on le verra plus loin, j'ai constaté que des passages, sur viande stérile ou dans l’organisme du cobaye, se sont montrés capables de modilier les propriétés du Proteus M à l'égard du maltose. Foutefois le pouvoir saccharolytique qui est apparu dans ces conditions s’est toujours montré beaucoup plus faible que celui

du Proteus V.

Appendice à l’action sur les hydrates de carbone.